miR-10a-5p靶向ITSN1对宫颈癌细胞增殖和顺铂化疗敏感性的影响

李 妘,王 静

(1陕西省汉中市中心医院妇科,汉中 723000;2陕西省肿瘤医院妇瘤科;*通讯作者,E-mail:yanghua422196@163.com)

宫颈癌(cervical cancer,CC)是一种常见的妇科恶性肿瘤,在女性癌症相关死亡疾病中,排名第4位[1]。相关数据显示,2018年全世界诊断宫颈癌新发病例569 847例,死亡病例311 365例[2]。目前,临床上宫颈癌的主要治疗手段包括手术、放疗及化疗,顺铂是临床上治疗宫颈癌的一线化疗药物,然而由于耐药性的产生,大多数患者预后仍不乐观[3,4]。微小RNA(microRNAs,miRNA)是一类小的非编码RNA,其通过结合抑制靶信使RNA(mRNAs)的3'非翻译区(UTR)在转录后基因调控中发挥重要作用[5]。目前,已有研究表明,miR-218、miR-501、miR-1284可通过调节其下游基因在多种肿瘤发生发展及耐药中发挥重要功能[6-10]。但是,miR-10a-5p在宫颈癌中的功能及作用机制是怎样的目前研究甚少。基于此,本研究对miR-10a-5p在宫颈癌细胞的增殖及对顺铂化疗敏感性的影响进行了研究,研究假设miR-10a-5p参与宫颈癌细胞的增殖及对顺铂化疗敏感性的影响,其作用机制可能与靶向交叉蛋白1(intersectin 1,ITSN1)相关。本研究对此假设进行验证,以期为宫颈癌的发生发展提供更深入的了解。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究所用到的23对宫颈癌组织及配对的癌旁正常组织标本均收集于2019年1月至2019年12月入住我院妇科经病理确诊为宫颈癌的患者。

1.2 材料和主要试剂

人宫颈癌细胞株Caski购自中国科学院细胞研究所(中国上海);实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)试剂盒购自广州锐博生物有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司;顺铂(冻干型)购自齐鲁制药(海南)有限公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁公司;GAPDH、ITSN1抗体及山羊抗兔IgG购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司;ECL发光液购自上海翊圣生物科技有限公司;过表达miR-10a-5p慢病毒及试剂盒购自上海吉凯基因科技有限公司;空载质粒、ITSN1野生型3′-UTR实验质粒、突变型3′-UTR实验质粒、miR-10a-5p-mimics及miR-10a-5p-NC购自长沙博楚生物科技有限公司。

1.3 细胞培养

使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(其中包含1%的青霉素+链霉素)培养人宫颈癌Caski细胞株,将细胞置于恒温培养箱中培养,温度设定为37 ℃,CO2浓度设置为5%。取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.4 细胞感染及分组

按密度为5×104个/ml将Caski细胞株重悬于感染增强液中,接种于24孔板中(每种细胞株均设置3个副孔),每孔体积为1 ml,在其中两孔中,按MOI=10,分别加入空载体病毒(阴性对照组)或miR-10a-5p过表达慢病毒(miR-10a-5p过表达组)混合液各2.5 μl,另一孔不做处理(空白对照组)。将24孔板放置于细胞培养箱中培养8-16 h,进行培养基更换,后将细胞株转移至培养瓶中进行培养及传代,以2 μg/ml浓度的嘌呤霉素筛选得到过表达及空载体病毒转染的宫颈癌细胞株,用于后续研究。

1.5 qRT-PCR检测患者组织及宫颈癌细胞中miR-10a-5p的表达

采用RNA抽提试剂盒提取患者肿瘤组织、配对的癌旁正常组织总RNA及空白对照组、阴性对照组、过表达组宫颈癌细胞总RNA,采用qRT-PCR检测组织、细胞中miR-10a-5p和三组细胞中ITSN1 mRNA表达水平,对于miR-10a-5p和RNA基因ITSN1,分别按照miDETECT A TrackTM、miRNA qRT-PCR、Starter Kit和riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit说明书要求加入各组分试剂,按照说明书设置反应条件,先进行逆转录制备cDNA文库,后进行PCR扩增,引物序列见表1。结果采用2-ΔΔCt法进行统计分析。

表1 引物序列

1.6 Western blot检测ITSN1蛋白表达水平

取1.4中三组处于对数生长期的细胞,弃去培养基,收集细胞,加入蛋白裂解液和PMSF,离心后上清液即为所需蛋白,利用BCA蛋白定量试剂盒,采用BCA法进行细胞蛋白浓度定量。然后,使用10%的十二烷基硫酸钠聚烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行电泳反应,随后进行转膜反应,转膜后使用脱脂牛奶室温进行封闭1 h,随后加入1∶1 000稀释的一抗兔ITSN1抗体,于4 ℃孵育过夜,以洗膜缓冲液(Tris buffered saline tween,TBST)清洗3遍,每遍10 min,于室温孵育二抗-山羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)1.5 h;以TBST清洗3遍,每遍10 min。进行曝光显影。

1.7 CCK-8检测miR-10a-5p对细胞增殖及对顺铂药物敏感性的影响

取1.4中三组处于对数生长期的细胞,接种于96孔板,接种浓度为5×103个/孔,每种细胞设置3个复孔,每种细胞共接种于5块板中,接种后第0,1,2,3,4天,于每孔加入10 μl的CCK-8溶液,细胞培养箱内继续孵育3 h后,使用吸光分度仪,设置参数波长为450 nm,测定吸光度;取上述三组处于对数生长期的细胞,接种于96孔板,接种浓度为5×104个/孔,每种细胞设置3个复孔,每种细胞共接种于5块板中,每块板分别加入配置好的顺铂溶液,使其浓度为0.4,0.8,1.2,1.6,2 μg/L,培养48 h后,于每孔加入10 μl的CCK-8溶液,细胞培养箱内继续孵育3h后,使用吸光分度仪,设置参数波长为450 nm,测定吸光度后进行计算。

1.8 miRNA靶基因预测及核心基因筛选

基于TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/)对miRNA进行靶基因预测,得到miRNA对应的所有靶基因,然后根据miRNA与基因的靶向调控关系构建miRNA调控基因的网络图,并通过网络分析,筛选出miRNA调控的核心基因。

1.9 双荧光素酶活性检测

宫颈癌细胞株Caski质粒共转染48 h后,检测萤火虫荧光素酶活性。向各孔中加入75 μl Dual-Glo@萤火虫荧光素酶试剂,混合均匀。10 min后,使用双荧光素酶报告分析系统检测读数,检测萤火虫荧光素酶反应强度RLU1;之后每孔添加75 μl Dual-Glo@Stop&Glo检测试剂,10 min后用双荧光素酶报告分析系统检测读数,检测内参海肾荧光素酶反应强度RLU2。计算两组数据比值(RLU1/RLU2),RLU1/RLU2比值可反映质粒荧光素酶的相对表达活性即细胞的转染效率。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 miR-10a-5p在宫颈癌组织中低表达

通过qRT-PCR检测23对宫颈癌及配对的癌旁正常组织发现,癌旁组织中miR-10a-5p表达量显著高于癌组织(14.38±0.237 2vs9.973±0.560 2,P=0.000 2,见图1)。

与癌旁正常组织相比,*P<0.05

2.2 稳定高表达miR-10a-5p Caski细胞系筛选

研究通过慢病毒感染Caski细胞,嘌呤霉素筛选后成功获得稳定高表达miR-10a-5p的Caski细胞系。qRT-PCR检测发现,与空白对照组相比,过表达组细胞中miR-10a-5p表达显著增高(1±0vs2.548±0.014),差异有统计学意义(P<0.000 1),与阴性对照组相比,过表达组细胞中miR-10a-5p表达显著增高(0.96±0.011vs2.548±0.014,P<0.000 1),而阴性对照组与空白对照组相比,细胞miR-10a-5p表达水平差异无统计学意义(P=0.912,见图2)。

与空白对照组相比,*P<0.05;与阴性对照组相比,#P<0.05

2.3 过表达miR-10a-5p对宫颈癌细胞增殖的影响

CCK-8法检测发现,在第4天,与空白对照组相比,miR-10a-5p过表达组吸光度明显降低,差异有统计学意义(P<0.000 1),与阴性对照组相比,miR-10a-5p过表达组吸光度明显降低,差异有统计学意义(P=0.002 6),而阴性对照组与空白对照组相比细胞吸光度差异无统计学意义(P=0.2,见图3)。通过以上数据可以得出miR-10a-5p能够明显抑制宫颈癌细胞的增殖。

与空白对照组相比,*P<0.05;与阴性对照组相比,#P<0.05

2.4 过表达miR-10a-5p对宫颈癌细胞化疗药物敏感性影响

与空白对照组相比,miR-10a-5p过表达组细胞在顺铂浓度为2.0 μg/L时处理后的生长抑制率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),与阴性对照组相比,miR-10a-5p过表达组细胞在顺铂浓度为2.0 μg/L时处理后的生长抑制率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组相比,细胞生长抑制率差异无统计学意义(见图4),提示过表达miR-10a-5p能够增强宫颈癌细胞对顺铂的化疗敏感性。

与空白对照组相比,*P<0.05;与阴性对照组相比,#P<0.05

2.5 三组间ITSN1的mRNA及蛋白表达水平比较

相对于空白对照组及阴性对照组,miR-10a-5p过表达组细胞ITSN1蛋白表达水平明显降低(见图5A)。相对于空白对照组,miR-10a-5p过表达组细胞ITSN1mRNA表达水平明显降低(P<0.05),相对于阴性对照组,miR-10a-5p过表达组细胞ITSN1mRNA表达水平明显降低(P<0.05),而阴性对照组细胞ITSN1 mRNA表达水平无明显差异(P=0.2,见图5B)。通过以上数据可以得出miR-10a-5p能够明显抑制宫颈癌细胞的增殖。

图5 Western blot和qRT-PCR检测三组细胞中ITSN1蛋白和mRNA水平

2.6 miR-10a-5p通过靶向作用ITSN1 3′-UTR抑制ITSN1表达

TargetScan软件预测到miR-10a-5p与其靶基因ITSN1 3′-UTR的结合位点(见图6A)。通过构建ITSN1 3′-UTR双荧光素酶报告质粒与突变质粒,双荧光素酶报告基因实验验证miR-10a-5p是目的基因ITSN1启动子区DNA的作用位点(见图6B)。

图6 miR-10a-5p通过靶向ITSN1 3′UTR抑制ITSN1的表达

3 讨论

宫颈癌为常见的妇科肿瘤,每年有数十万的新增病例,严重损害了患者的身心健康[2]。同步放化疗是针对晚期宫颈癌患者的标准治疗策略[11]。但是,耐药性的产生使临床治疗效果并不理想。因此,阐明耐药的潜在机制,寻求宫颈癌的潜在治疗靶标至关重要。众所周知,miRNA与包括宫颈癌、乳腺癌和膀胱癌在内的多种疾病的进展和耐药性相关[12]。有研究表明,miR-218可以通过直接下调IDO1进而抑制宫颈癌细胞的免疫逃逸反应[8]。miR-501可以通过靶向CYLD来促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[9]。miR-1284可通过靶向HMGB1增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性[10]。此外,miRNA也被认为是肿瘤的治疗靶点[13]。文献报道,在非小细胞肺癌中,miR-10a-5p可以调节肿瘤细胞的增殖和侵袭性并且可用于临床诊断[14]。通过抑制miR-10a-5p靶向TFAP2C可以降低人类胰腺导管腺癌(PDAC)的迁移和侵袭能力,在肿瘤的发生和耐药中起重要作用[15]。本研究通过对宫颈癌及配对的癌旁组织检测,发现miR-10a-5p在宫颈癌组织中的表达低于癌旁配对正常组织,这提示miR-10a-5p可能参与调控宫颈癌的发生。本研究通过慢病毒感染的方法构建miR-10a-5p过表达细胞株,进一步发现在宫颈癌细胞株中,具有抑制肿瘤增殖及增加顺铂化疗敏感性的影响。文献报道,miRNA可以通过特异性调控靶基因ITSN1,在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用[16,17]。ITSN1是一种细胞衔接蛋白,主要参与网格蛋白介导的胞吞胞吐、细胞骨架重排和细胞信号传导等生物学过程[18]。在乳腺癌中,过表达ITSN1可通过调节Ki67和Caspase-3的表达水平来抑制细胞增殖并促进细胞凋亡[19]。ITSN1-L可通过FAK/整合素β3途径减弱细胞与基底的黏附抑制神经胶质瘤肿瘤进展[20]。根据靶基因预测分析,我们发现ITSN1为miR-10a-5p的靶基因,并且进一步通过荧光素酶报告基因实验确定ITSN1可以与miR-10a-5p结合。

综上所述,miR-10a-5p在宫颈癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,过表达miR-10a-5p可以明显降低宫颈癌细胞的增殖能力,并且增强了对化疗药物顺铂的药物敏感性,其作用机制可能是通过靶向ITSN1发挥作用的。以上研究提示miR-10a-5p可能为宫颈癌的潜在治疗靶点,但仍需进一步实验证明。