右美托咪定通过上调miR-579-3p减轻心肌细胞缺氧复氧后的凋亡

姜玉玉,尹天玥,李小雨,于 汝,程向阳

(蚌埠医学院第一附属医院麻醉科,蚌埠 233030;*通讯作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

冠心病常伴心脏缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤,是引起心力衰竭的主要原因之一[1-3]。既往对心肌I/R损伤发病机制的研究多集中在氧自由基、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、内皮细胞损伤等方面[4]。近年来,为了防止I/R损伤,一些药理学策略被广泛研究[5,6]。

凋亡已被发现是心肌I/R损伤的基础[7],心肌缺血后不久即开始凋亡过程,再灌注时凋亡明显增强[8]。由于心肌细胞是没有或几乎没有再生潜能的终末分化细胞,因此防止心肌细胞在I/R损伤后的凋亡是一项重要的临床治疗策略。

右美托咪定是一种选择性α2肾上腺素受体激剂,具有抗焦虑、镇静和镇痛作用,被广泛应用于临床麻醉[9,10]。右美托咪定在神经保护方面具有潜在的应用前景,此外,它还对于很多器官,包括肝、肺、肾和心肌都有保护作用[11]。右美托咪定预处理保护了心肌细胞免受I/R损伤[12],然而其保护机制需要进一步研究。

miRNA是一类长度约为22 bp的非编码小RNA,可以通过结合mRNA的3′非翻译区(3′UTR)抑制基因表达[13]。越来越多的数据表明,miRNA表达异常与多种心血管疾病有关,包括心肌I/R损伤[14]。MiR-579-3p在多种肿瘤中均低表达。miR-579-3p低表达与肿瘤的发生密切相关[15]。一项动物脑I/R损伤模型报道,miR-579-3p可通过抑制炎症和细胞凋亡,部分减轻脑I/R损伤[16]。

因此我们推测,调控miR-579-3p可能是右美托咪定减轻心肌I/R损伤的机制。本研究通过建立心肌细胞缺氧复氧损伤模型,研究右美托咪定对心肌I/R损伤的影响,以及右美托咪定减少心肌I/R损伤与miR-579-3p之间的关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料

miR-579-3p inhibitor、miR-579-3p inhibitor NC(miR-579-3p inhibitor空白对照)、miR-579-3p引物购自上海吉玛公司;Lipofectamine购自美国Invitrogen公司;DMEM/F12培养基,胎牛血清购自Gibco公司;Ⅱ型胶原酶购自北京Solarbio公司;CCK-8检测试剂盒,Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;兔源抗Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3抗体购自美国Affinity公司;兔源抗GAPDH抗体,HRP标记的羊抗兔二抗购自Biosharp公司。

1.2 动物

1-3 d SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠购自蚌埠医学院实验动物中心,合格证号:20180004002485。

1.3 细胞培养

取1-3 d的乳鼠颈椎脱臼处死,75%酒精消毒60 s,取出乳鼠的心脏,以预冷D-Hanks液清洗3次,剪碎,用含有0.07%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型胶原酶的混合酶37 ℃消化5 min,沉淀1 min后,取消化后的细胞上清液置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中终止消化,消化过程约5次。含细胞上清液的DMEM/F12培养基1 000 r/min离心5 min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基混匀,收集细胞悬液于37 ℃、5%CO2培养箱中差速贴壁90 min,吸取细胞悬液,接种于另一培养瓶,培养24 h后换液。待细胞密度约60%时,建立心肌细胞缺氧/复氧模型。弃去培养基,更换为不含胎牛血清的无糖DMEM培养基,在1%O2和5%CO2的三气培养箱中缺氧6 h后,置换含胎牛血清的DMEM/F12培养基,并于5%CO2,95%空气培养箱中继续培养6 h进行复氧处理。

1.4 细胞处理与分组

为了确定不同浓度右美托咪定对缺氧复氧刺激后心肌细胞活性的影响,我们在缺氧复氧时分别给予0.01,0.1,1 μmol/L右美托咪定处理。

为检测右美托咪定对心肌细胞缺氧复氧的影响,将细胞随机分为5组:①control组在完全培养基中,37 ℃,5%CO2,常氧条件下培养12 h。②H/R组用无糖培养基替代完全培养基,在37 ℃,5%CO2、94%N2,1%O2条件培养6 h,随后替换完全培养基,37 ℃,5%CO2,常氧条件下继续培养6 h。③H/R+Dex组进行1 μmol/L右美托咪定给药后缺氧复氧处理。④H/R+Dex+NC组在转染miR-579-3p inhibitor NC 24 h后,进行右美托咪定给药和缺氧复氧处理。⑤H/R+Dex+inhibitor组在转染miR-579-3p inhibitor 24 h后,进行右美托咪定给药和缺氧复氧处理。

1.5 qRT-PCR检测miR-579-3p表达

使用Trizol试剂提取各组细胞总RNA,定量后吸取1 μg总RNA产物,采用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以cDNA为模板,使用StepOne Plus荧光定量PCR系统和SYBR Green试剂盒进行qRT-PCR测定miR-579-3p表达。以U6作为内参。引物序列见表1。

表1 miRNA引物序列

1.6 CCK-8实验检测心肌细胞活力

将心肌细胞消化并重悬,接种于96孔板(1×104个细胞/孔),每组3个复孔。经上述处理后,每孔分别加入CCK-8试剂10 μl,37 ℃孵育1 h。测定450 nm处吸光度值。

1.7 细胞凋亡检测

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。各组细胞经相应处理后,收集细胞,用1×结合缓冲液重悬细胞。将细胞悬液调整为1×106/ml。加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl碘化丙啶(PI),轻轻混匀,室温(20-25 ℃)避光孵育15 min。使用FACSCaliburTM分析各组细胞凋亡所占百分比。

1.8 Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白的表达

各组细胞经过不同处理后,收集细胞,在含苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的RIPA裂解液中冰上裂解30 min,12 000 r/min离心15 min,收集上清作为细胞总蛋白。分别将等质量的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭,孵育一抗,包括Bcl-2(1∶1 000),Bax(1∶1 000),cleaved Caspase-3(1∶1 000),GAPDH(1∶3 000),4 ℃孵育过夜。然后,用TBST洗膜,室温孵育HRP标记的羊抗兔二抗(1∶10 000)1 h,使用ECL进行显影,放入成像系统进行曝光。用ImageJ软件分析免疫反应条带密度,GAPDH作为内参。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 右美托咪定对缺氧复氧诱导的心肌细胞活性的影响

与control组相比,H/R组心肌细胞活性显著降低(P<0.05);与H/R组相比,H/R+0.1 μmol/L Dex组细胞活力显著增加(P<0.05);与H/R组相比,H/R+1 μmol/L Dex组细胞活力显著增加(P<0.05),与H/R+0.1 μmol/L Dex组相比,H/R+1 μmol/L Dex组细胞活力增加(见图1),因此以1 μmol/L浓度的右美托咪定进行后续实验。

与control组相比,*P<0.05;与H/R组相比,#P<0.05

2.2 右美托咪定对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

流式细胞术结果表明,与control组相比,H/R组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),而与H/R组相比,H/R+Dex组凋亡率明显下降(P<0.05,见图2)。Western blot结果显示,与control组相比,H/R组Bcl-2降低,Bax,cleaved Caspase-3升高(P<0.05),而与H/R组相比,H/R+Dex组Bcl-2升高,Bax,cleaved Caspase-3降低(P<0.05,见图2)。

与control组相比,**P<0.01;与H/R组相比,#P<0.05,##P<0.01

2.3 右美托咪定对H/R处理后心肌细胞中miR-579-3p表达的影响

与control组相比,H/R组miR-579-3p表达显著降低(P<0.01);与H/R组相比,H/R+Dex组miR-579-3p表达升高(P<0.05,见图3)。此外,转染miR-579-3p inhibitor结果提示,与NC组相比,inhibitor组miR-579-3p表达显著降低(P<0.01,见图3)。

与control组相比,*P<0.05;与H/R组相比,#P<0.05与NC组相比,**P<0.01

2.4 右美托咪定通过提高miR-579-3p表达缓解心肌细胞缺氧复氧损伤

流式细胞术结果表明,与H/R组相比,H/R+Dex组凋亡率明显降低(P<0.01);与H/R+Dex组相比,H/R+Dex+inhibitor组凋亡率显著升高(P<0.05,见图4)。Western blot结果表明,与H/R组相比,H/R+Dex组Bcl-2升高,Bax,cleaved Caspase-3降低(P<0.05);与H/R+Dex组相比,H/R+Dex+inhibitor组Bcl-2降低,Bax,cleaved Caspase-3表达升高(P<0.05,见图4)。

与H/R组相比,**P<0.01;与H/R+Dex组相比,#P<0.05,##P<0.01

3 讨论

右美托咪定用于重症监护病房和手术室手术前或手术期间的麻醉和镇静。越来越多的证据表明右美托咪定在许多病理过程中,特别是在缺血/再灌注损伤中,对器官发挥保护作用。在心血管系统,体内和体外大鼠心脏I/R模型中,右美托咪定预处理可显著改善缺血后心肌功能,降低心肌梗死面积[11-17]。凋亡是I/R损伤过程中的关键事件,在其发生与发展中起着重要作用[18]。miRNA在转录后水平调控约60%基因表达,并在缺血/再灌注损伤中发挥重要作用[19]。miRNA在缺血刺激反应中的作用逐渐成为缺血后心肌保护和恢复的靶点。miR-579-3p在脑I/R损伤中具有抗凋亡作用,因此,我们猜测其在心肌I/R损伤中也可能具有类似作用。为因此,我们建立了心肌细胞缺氧复氧模型研究miR-579-3p在心肌I/R损伤中的作用。在这个模型中,细胞被放置在一个低氧环境中数小时后返回到常氧环境,这可以模拟心肌I/R损伤,对于研究心肌损伤是一个有用的工具[20]。

本研究结果显示,与H/R组相比,H/R+Dex组Dex预处理不仅提高了miR-579-3p表达,而且也增加了心肌细胞活性,说明右美托咪定可以改善缺氧复氧后心肌细胞活力,降低心肌细胞凋亡,这与之前的研究结果一致。本研究结果表明,与H/R+Dex组相比,H/R+Dex+inhibitor组通过降低miR-579-3p表达,从而降低了心肌细胞活性。提示右美托咪定的心肌细胞保护作用可能是通过提高miR-579-3p表达实现的。这些结果可能对于减少包括I/R损伤在内的心脏综合征具有重要的临床意义。

综上所述,右美托咪定可以减轻原代心肌细胞H/R损伤,而其保护作用可能是通过升高miR-579-3p表达,抑制凋亡实现的。其在临床中的应用还需要进一步的研究来证实。