miRNA103在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的作用

何 雷,徐金升,白亚玲,张慧然,周 薇,张胜雷,刘 兰,张彤彤

(河北医科大学第四医院肾内科,石家庄 050011;*通讯作者,E-mail:xjs5766@126.com)

血管钙化(vascular calcification,VC)与心血管疾病和慢性肾脏病患者的死亡率有关[1],且在慢性肾脏病患者全因死亡率中占第一位[2]。血管钙化是一个复杂的过程,涉及不同的分子途径,而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)在血管钙化的形成和发展中具有重要的作用[3,4]。研究显示,VSMCs钙化与成骨信号通路有关[5],此外,成骨信号通路和VC的主要特征是核心转录因子2(Runx2)的特异性上调[6]。研究发现,miRNAs通过参与VSMCs向成骨样细胞的转分化,进而参与血管钙化[7]。miR-103是miR-15/107家族的一员,在人体组织中广泛表达[8]。miRNAs数据库基因预测分析miR-103参与血管钙化的发生发展。且已有报道显示,miR-103能够抑制动脉粥样硬化的进展[9]。我们推测miR-103在细胞转分化中起一定作用,进而影响血管钙化。为此,本研究以体外培养的大鼠VSMCs为研究对象,探讨miR-103在高磷诱导的大鼠VSMCs钙化发生过程中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

β-甘油磷酸购自Sigma公司;DMEM培养液及胎牛血清均购自Gibco公司;RNA提取及反转录试剂盒均购自Thermo Fisher公司;实时荧光定量PCR试剂购自广州易锦公司;miR-103的类似物与抑制物购自锐博公司;茜素红S染料购自Solarbio公司;碱性磷酸酶测定试剂盒购自南京建成生物公司;钙含量测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司;碱Runx2抗体购自Abcam公司;GAPDH抗体购自Bioworld公司。

1.2 实验模型的制备与分组

取4周龄、体质量约80-100 g的清洁级雄性健康SD大鼠(由河北医科大学实验动物中心提供,合格证编号:1305090)。体外分离大鼠胸主动脉,并将血管剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块,采用组织贴壁法,将组织块贴于瓶底,进行原代培养,传代至第3-4代,将细胞分为正常组和高磷组(给予10 mmol/L β-甘油磷酸盐,HP组),刺激4 d后,检测VSMCs的钙化情况、ALP活性,及miR-103和Runx2的表达情况。为进一步验证miR-103对VSMCs的作用,分为6组:正常组,完全培养基;NC inhibitor组,转染抑制物的对照NC inhibitor;miR-103 inhibitor组,转染抑制物miR-103 inhibitor;高磷组(HP),高磷环境细胞未转染;NC mimic+HP组,高磷环境转染类似物的对照(NC mimic);miR-103 mimic+HP组,高磷环境转染类似物miR-103 mimic。转染后72 h,测定VSMCs的钙化情况、ALP活性,及miR-103和Runx2的表达情况。

1.3 茜素红钙化染色

将12孔板内培养的第3代VSMCs给予干预后弃去上清,用95%乙醇室温固定20-30 min,茜素红染液(pH8.4,浓度为0.1%)染色1 h,倒置显微镜下观察并记录。结果判断标准:橘红色结节为钙盐沉积。

1.4 细胞钙含量测定

12孔板内培养的VSMCs给予干预后弃去上清,加入1 mol/L的盐酸37 ℃脱钙过夜,取上清液,使用邻甲酚酞络合酮比色法测定钙含量,细胞用0.1 mol/L氢氧化钠溶液和0.1%十二烷基硫酸钠溶解30 min,使用BCA法测定各组细胞蛋白质含量,结果用蛋白含量校准(mg/g蛋白)。

1.5 ALP活性测定

将培养的VSMCs弃上清,磷酸盐缓冲溶液冲洗2次,加入1%聚乙二醇辛基苯基醚生理盐水,置于4 ℃冷藏24 h后离心,取上清液,测定其活性,结果用蛋白质校准(U/g)。

1.6 实时荧光定量检测Runx2表达

提取刺激后VSMCs的miRNA和mRNA,测定miRNA及Runx2的表达。miR-103及5s引物由锐博公司提供,5s为内参,反应条件:预变性95 ℃ 10 min;变性95 ℃ 10 s;退火60 ℃ 20 s;延伸72 ℃ 10 s。Runx2 mRNA PCR引物由Primer 5.0软件设计,引物序列见表1。GAPDH为内参,反应条件:即预变性95 ℃ 10 min;变性95 ℃ 20 s;退火60 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 20 s。记录数据,实验重复3次。

表1 引物序列

1.7 Western印迹法检测VSMCs目的蛋白表达

提取各组细胞蛋白,测定Runx2蛋白的表达。取50 μg蛋白质加入10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中,恒压95 V电泳1.5 h,恒压95 V转膜1 h,牛奶封闭1 h,加入一抗稀释液(Runx2 1∶500,GAPDH 1∶5 000),4 ℃孵育过夜。次日洗膜,放入二抗稀释液(1∶5 000),室温下孵育1 h,于蛋白成像仪上显色。实验重复3次。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 高磷可以引起VSMCs钙化增加

2.1.1 VSMCs茜素红染色及钙含量测定 茜素红染色显示,高磷组较正常组的橘红色钙化结节显著增多;钙含量结果显示,高磷组VSMCs的钙含量显著升高(P<0.05,见图1)。

图1 两组VSMCs钙化的表达情况

2.1.2 高磷引起大鼠VSMCs Runx2表达升高和ALP活性增加 实时荧光定量PCR和Western结果显示,与正常组比较,给予β-GP干预后,高磷组Runx2 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05),ALP活性显著增强(P<0.05,见图2)。

与正常组比较,*P<0.05

2.2 高磷引起大鼠VSMCs miR-103表达降低

实时荧光定量PCR结果显示,与正常组比较,给予β-GP干预后,高磷组的miR-103的表达显著下降(P<0.05,见图3)。

与正常组比较,*P<0.05

2.3 miR-103导致VSMCs钙化降低

2.3.1 miR-103对VSMCs茜素红染色及钙含量测定的影响 茜素红染色显示,与NC inhibitor组比较,miR-103 inhibitor组橘红色钙化结节显著增多,钙离子含量显著升高(P<0.05);与NC mimic+HP组相比,miR-103 mimic+HP组的橘红色钙结节显著减少,钙离子含量显著降低(P<0.05,见图4)。

与正常组或高磷组比较,*P<0.05;与相应的NC组比较,#P<0.05

2.3.2 miR-103导致VSMCs Runx2表达降低和ALP活性降低 实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示,与NC inhibitor组比较,miR-103 inhibitor组的Runx2表达水平显著升高(P<0.05);与NC mimic+HP组比较,miR-103 mimic+HP组的Runx2表达水平显著降低(P<0.05,见图5)。ALP活性测定结果显示:与NC inhibitor组比较,miR-103 inhibitor组的ALP活性显著升高(P<0.05);与NC mimic+HP组比较,miR-103 mimic+HP组的ALP活性显著降低(P<0.05,见图6)。

与正常组或高磷组比较,*P<0.05;与相应的NC组比较,#P<0.05

与正常组或高磷组比较,*P<0.05;与相应的NC组比较,#P<0.05

3 讨论

血管钙化是慢性肾脏病患者心血管疾病发病率高的主要原因[10]。高磷血症是导致血管中膜钙化的重要危险因素,VSMCs是血管中膜的重要组成成分[11]。研究表明,VSMCs钙化发生的重要机制之一是VSMCs的表型转化[5]。本研究通过体外培养原代大鼠VSMCs,发现高磷可诱导VSMCs发生钙化,可能是通过抑制miR-103表达,促进了VSMCs表型转化,进而促进了VSMCs钙化。

钙磷代谢紊乱时,VSMCs由收缩表型转化为成骨/软骨细胞样表型来介导血管钙化[12]。成骨转录因子Runx2和矿化调节蛋白ALP的特异性上调是成骨和VC的主要特征。因此Runx2是VSMCs发生表型转化的标志,而ALP是血管钙化发生的经典生物标志物[13,14]。本研究证明了给予高磷刺激,可以诱导VSMCs钙化,促进Runx2表达,增加ALP活性,提示高磷可以诱导VSMCs发生表型转化,进而引起VSMCs钙化。

有研究证明miRNAs通过参与血管平滑肌细胞向成骨细胞样细胞的转分化而参与血管钙化[6]。miR-103属于miR-15/107家族,是一种进化保守的miRNA,在人体正常组织中广泛表达,并参与癌症及炎症等疾病的发展[15]。研究显示,miR-103可负性调节SATB同源盒2,抑制人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[16]。本研究显示高磷环境,miR-103表达下调,提示高磷环境可抑制miR-103表达。为进一步证明miR-103对VSMCs的影响,本研究在VSMCs中给予了转染miR-103的类似物与抑制物。结果显示,给予miR-103抑制物后VSMCs钙化增加,且Runx2表达和ALP活性均升高;高磷环境给予miR-103类似物后VSMCs钙化减低,且Runx2表达和ALP活性均显著降低。进一步证明了miR-103可负向调节Runx2表达,在VSMCs钙化过程中起抑制作用。

综上所述,高磷可诱导VSMCs钙化,可能机制之一是高磷通过抑制VSMCs中miRNA-103表达,促进Runx2表达,从而诱导VSMCs表型转化,进而促进VSMCs钙化的发生。