miR-223、miR-324-5p与慢性乙肝肝纤维化的相关性及其临床诊断价值

杨 荔,王海霞,孟小芬,田银娣,薛云珠,白小龙,逯 云,路 燕,雷焕勤,孙 蕾,卢 乐

(1西安交通大学第二附属医院普通外科,西安 710004;2西安医学院第二附属医院外科;3西安交通大学第二附属医院感染科;*通讯作者,E-mail:369758180@qq.com)

慢性乙型肝炎患者的肝纤维化过程为一个动态的进展过程,肝实质细胞损伤、炎症等过程均参与了肝纤维化的发生发展[1]。目前抗病毒治疗是慢性乙型肝炎的主要治疗思路,而肝纤维化的程度是抗病毒治疗的重要指征,准确地评估肝纤维化的程度能够为临床慢性乙型肝炎的治疗时机及方法的选择提供思路[2]。肝组织活检费用较高,且属于有创检查方法,患者的接受度一般。近年来,关于肝纤维化的无创诊断方法的研究是国内外学者探索的热点,血清学指标、生物学标志物等在肝纤维化的诊断中均取得了一定的进展[3,4]。miR-223近几年被发现与肝炎、酒精性肝损伤、药物性肝损伤有关[5-7],近期又被报道可参与其他器官如心肌细胞纤维化的过程[8];近年有少许研究报道miR-324-5p可能与肝癌[9]及酒精性肝损伤[10]、炎症反应所致肝损伤[11]有关,但是miR-223和miR-324-5p与乙型病毒性肝炎及肝纤维化的关系尚不明确。因此,本研究对miR-223和miR-324-5p在乙型病毒性肝炎及肝纤维化中的表达情况进行观察,并分析其与肝纤维化的关系以及对病情的评估作用,以期为进一步的机制研究提供导向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究为前瞻性研究,随机选取本院2018年1月至2019年12月收治的80例慢性乙型肝炎患者为乙肝组;男45例,女35例;平均年龄(42.54±8.23)岁。纳入标准:符合《慢性乙型肝炎防治指南》[12]的诊断标准;乙型肝炎表面抗原连续6个月以上检测为阳性;乙型肝炎病毒基因≥105 IU/ml;丙氨酸氨基转移酶高于正常水平的1-2倍。排除标准:甲型、丙型、戊型肝炎患者;酒精性肝病、药物性肝损伤患者;合并内分泌系统疾病和自身免疫性疾病的患者;患有恶性肿瘤的患者;合并脑血管疾病的患者。80例乙肝组患者根据肝组织活检Metavir评分标准[13]判断其肝纤维化程度,其中F0级(无纤维化)20例,F1级(局限性纤维化)24例,F2级(扩大纤维化)12例,F3级(无肝硬化)14例,F4级(肝硬化)10例。将乙肝组根据有无发生肝纤维化分为无肝纤维化组(20例,F0级)和肝纤维化组(60例,F1-F4级):无肝纤维化组,男11例,女9例,平均年龄(44.10±9.12)岁;肝纤维化组,男34例,女26例,平均年龄(42.02±7.93)岁。随后再将乙肝组根据肝纤维化程度分为轻中度肝纤维化组(44例,F0-F1级)和重度肝纤维化组(36例,F2-F4级):轻中度肝纤维化组,男24例,女20例,平均年龄(42.73±8.13)岁;重度肝纤维化组,男21例,女15例,平均年龄(42.31±8.47)岁。

另选取同期在本院进行体检的80例健康者为对照组;男40例,女40例;平均年龄(42.48±8.30)岁。

各组基线年龄、性别均具有可比性(P>0.05)。本研究经院伦理委员会批准(No.20171202),符合知情同意原则。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-223和miR-324-5p水平检测 采集受试者清晨空腹肘静脉血5 ml离心后取血浆,Trizol法提取总RNA,逆转录后应用SYBR RT-PCR试剂盒行RT-PCR,引物设计见表1。以U6为管家基因计算血清中miR-223和miR-324-5p的相对表达水平2-ΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-管家基因Ct值),行3次平行实验后求均数及标准差并进行不同组组间比较。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.2 血清miR-223和miR-324-5p水平与乙型肝炎肝纤维化的关系 分析并比较无肝纤维化组与肝纤维化组乙型肝炎患者血清miR-223、miR-324-5p水平的差异,并分析血清miR-223、miR-324-5p水平与乙型肝炎肝纤维化发生情况的关系。

1.2.3 诊断效能分析 分别将《慢性乙型肝炎防治指南》[12]和Metavir评分标准[13]作为乙型肝炎和肝纤维化诊断的金标准,进行血清miR-223和miR-324-5p水平单独检测及联合检测的ROC曲线下面积(AUC)分析和诊断效能分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组血清miR-223和miR-324-5p水平比较

t检验结果显示,乙肝组患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);肝纤维化组患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均显著高于无肝纤维化组患者,差异均有统计学意义(P<0.05);重度肝纤维化组患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均显著高于轻中度肝纤维化组患者,差异均有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 各组血清miR-223和miR-324-5p水平比较

2.2 血清miR-223和miR-324-5p水平与乙型肝炎肝纤维化的关系

采用逐步回归的方法,对miR-223和miR-324-5p水平与乙型肝炎肝纤维化的关系进行二元Logis-tics(无肝纤维化=0,肝纤维化=1),最终拟合方程logit(P)=-5.414+4.508×miR-223(见表3),提示miR-223是肝纤维化的独立危险因素。

表3 miR-223和miR-324-5p水平与乙型肝炎肝纤维化关系的二元Logistics回归分析

2.3 两指标单独及联合检测诊断乙型肝炎的ROC曲线及诊断效能分析

将miR-223和miR-324-5p共同纳入乙型肝炎诊断的ROC曲线分析,miR-223和miR-324-5p各自单独及两者联合在乙型肝炎诊断中的AUC分别为0.855,0.818,0.879,均有统计学意义(P<0.05);miR-223诊断乙型肝炎的最佳分界点为1.36,miR-324-5p为1.45,以miR-223和miR-324-5p的最佳分界点为乙型肝炎的阳性判断标准,统计各指标单独及联合检测对乙型肝炎的诊断效能,发现联合检测的准确度、特异度均优于各指标单独检测(见图1,表4)。

图1 各指标单独及联合检测诊断乙型肝炎的ROC曲线

表4 miR-223和miR-324-5p诊断乙型肝炎ROC曲线下方面积(AUC)及诊断效能

2.4 各指标单独及联合检测诊断重度肝纤维化的ROC曲线及诊断效能分析

将miR-223和miR-324-5p共同纳入重度肝纤维化诊断的ROC曲线分析,miR-223和miR-324-5p及两者联合在重度肝纤维化诊断中的AUC分别为0.792,0.676,0.830,均有统计学意义(P<0.05);miR-223诊断重度肝纤维化的最佳分界点为1.49,miR-324-5p为1.64,以miR-223和miR-324-5p的最佳分界点为重度肝纤维化的阳性判断标准,统计各指标单独及联合检测对重度肝纤维化的诊断效能,发现联合检测的准确度、敏感度均优于各指标单独检测(见表5,图2)。

表5 miR-223和miR-324-5p诊断重度肝纤维化ROC曲线下方面积(AUC)及诊断效能

图2 miR-223和miR-324-5p单独及联合检测诊断重度肝纤维化的ROC曲线

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化过程中的主要病理学改变,在此过程中,肝星状细胞活化机制是目前学者们研究的热点,也是肝纤维化发生的中心环节[14]。micorRNA是一类具有调控功能的非编码RNA,可以通过碱基互补配对的方式识别靶基因,参与多种生物调节途径。经证实,在肝星状细胞活化过程中,多种micorRNA均发挥重要的调节作用,但国内外关于micorRNA在肝炎或肝纤维化诊断中作用的相关研究目前较少[15]。

miR-223定位在X染色体q12上,其表达受多个转录因子的调控,参与人体免疫反应、炎症反应、感染、血液系统、心血管系统等多方面的病理生理调控过程[16],有研究发现,其在肝细胞癌患者血清中的含量较健康人群明显增高[17]。一项肝脏损伤动物模型的相关研究发现,miR-223的转录水平与肝损伤的血清学标记物之间为显著正相关关系,提示miR-223的异常表达参与了肝损伤的关键过程[18],且最新研究也发现,miR-223的靶基因数量接近40个,在肝癌等肿瘤的病理生理过程中均发挥重要的调控作用[19]。miR-324-5p基因定位于染色体17p13.1,经证实与多种人类肿瘤有关[9],并且在肝细胞癌中也呈高表达[10]。董晓龙[11]研究发现,采用乙醇刺激人肝癌细胞株Bel7402以及大鼠正常肝细胞株BRL后,miR-324-5p表达上调,提示miR-324-5p参与了乙醇所致肝细胞损伤。韩永艳等[20]研究发现,miR-324-5p是急性胰腺炎肝损伤的独立危险因素,并且miR-324-5p可用于预测急性胰腺炎并发肝损伤,提示miR-324-5p可能和炎症反应所致肝细胞损伤有关,但具体作用机制不明。综上所述,尽管目前对micorRNA在肝损伤以及肝纤维化中的研究较多[21],但是目前围绕miR-223和miR-324-5p与乙型病毒性肝炎及肝纤维化的关系研究较少。

陈超[22]在对肝纤维化大鼠模型肝组织及原代肝星状细胞的研究中,对肝纤维化相关的micorRNA进行了筛选和功能研究,研究结果显示miR-223和miR-324-5p在肝纤维化过程中的表达均为明显升高状态;生物学信息分析结果也提示,miR-223和miR-324-5p在肝星形细胞的活化中可能参与了肝星形细胞的迁移。在本研究中,乙肝组患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均显著高于对照组,表明在慢性乙型肝炎病毒感染患者的血清中,miR-223和miR-324-5p均处于表达上调的状态;进一步分析发现,肝纤维化患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均显著高于无肝纤维化组患者,而重度肝纤维化组患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均显著高于轻中度肝纤维化组患者,进一步印证了陈超[22]的研究结论。随后,为了进一步分析miR-223和miR-324-5p与乙型肝炎及肝纤维化程度的关系,并探讨两者在乙型肝炎及肝纤维化程度诊断中的诊断价值,我们首先通过二元Logistics逐步回归分析,证实miR-223是乙肝感染患者发生肝纤维化的独立危险因素,但是由于无肝纤维化组患者样本量相对较少,而且所纳入研究的协变量较少,因此导致95%置信区间上限较大,因此,仍需进一步纳入更大样本量以及观测指标以进行深入研究。随后,我们通过对miR-223和miR-324-5p水平在乙型肝炎及肝纤维化程度诊断中的效能进行分析,发现miR-223和miR-324-5p及两者联合可用于乙型肝炎和重度肝纤维化的诊断,而且两者联合能够大大提升乙型肝炎和重度肝纤维化诊断结果的准确性。

综上所述,miR-223可能是乙肝感染患者发生肝纤维化的独立危险因素;外周血miR-223和miR-324-5p水平可有效反映乙型肝炎病毒的感染情况和肝纤维化程度,同时监测两者表达水平,有助于对肝纤维化程度的判断。因此,在今后的研究中,我们将进一步围绕miR-223和miR-324-5p与乙肝肝纤维化的发生发展机制,从分子生物学水平进行深入研究。