不同亚型急性脑卒中患者外周血中T淋巴细胞亚群的分布

张海岳,关经纬,孔 琦,褚 敏,宋海庆,孟 然

(首都医科大学宣武医院神经内科,北京 100053;*通讯作者,E-mail:victor65@126.com)

脑卒中根据发病机制不同可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中[1,2],其中约87%的脑卒中患者为缺血性脑卒中[3]。缺血性脑卒中发生后可迅速启动一系列免疫应答和炎症反应,是卒中后诱发脑组织损伤和修复的重要病理反应[4,5]。我们前期的动物实验研究发现,调节外周血中免疫细胞(主要包括T淋巴细胞亚群)的数量和功能,可有效改善脑缺血动物模型的卒中结局,达到脑保护的作用[6]。这些结果表明T淋巴细胞亚群在脑卒中发病和治疗中发挥重要作用。

既往大量研究也发现T淋巴细胞及其亚群在缺血性脑卒中发病早期就被募集和激活,特别是CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞大量浸润脑缺血区域,分别通过诱导白介素、细胞毒素和穿孔素等炎症介质的产生,造成神经元细胞的坏死和损伤[7,8]。但是,目前有研究提出由于不同病因引起的脑缺血的部位、面积和程度不同,发生的免疫应答反应也有所差别[9]。其中T淋巴细胞亚群在不同类型缺血性脑卒中急性期的作用是否有差异还没有统一定论。本研究旨在分析T淋巴细胞亚群在大动脉粥样硬化性卒中患者和小动脉闭塞性卒中患者在急性期外周血中分布,探讨不同病因缺血性脑卒中患者急性期免疫反应的差异。

1 材料和方法

1.1 患者临床资料

连续纳入2019年4月至2020年6月就诊于首都医科大学宣武医院的急性缺血性脑卒中患者共40例。研究前经首都医科大学宣武医院伦理委员会的审查和批准(伦理号:[2018]117),并在研究中获得了患者知情同意。纳入患者临床资料见表1。

表1 两组纳入患者的基本临床资料Table 1 Patient characteristics in two groups

纳入标准:①年龄18-80岁;②急性脑卒中发病到医院就诊时间≤7 d;③磁共振弥散序列成像(MRI-DWI)确认为新发缺血性脑卒中;④通过颈动脉血管超声、经颅多普勒超声(TCCD)、头部及颈部CT血管成像、头部MRA或数字减影血管造影(DSA)明确病因;⑤已超过静脉溶栓时间窗并且已不能进行血管内治疗的患者。

排除标准:①病因不明;②使用任何免疫抑制剂;③患有免疫性疾病;④严重心脏、肝脏及脾脏疾病。

分组依据:根据TOAST分型诊断标准[10],将纳入患者分为大动脉粥样硬化性卒中和小动脉闭塞性卒中两组。

1.2 流式细胞仪检测T细胞亚群

所有纳入患者在接受治疗前通过肘部采集外周血,用于流式细胞仪检测(BD LSRII,Becton Dickinson公司,美国)。所用抗体均购买于BD Pharmingen公司(美国)或BioLegend公司(美国)。流式细胞仪检测方法:①采集患者静脉血,充分抗凝。②每管取100 μl抗凝全血至流式管,按荧光抗体染色组合加入各自抗体。③将血液与荧光标记抗体混匀后室温避光反应20 min。④每个样品管加入1×红细胞裂解液,混匀后室温避光孵育10 min。⑤300g离心5 min,弃上清。⑥每个样品管中加入流式细胞洗液,混匀后300g离心5 min,弃上清。⑦向每个样品管中再次加入流式细胞洗液,混匀后4 ℃避光,及时用流式细胞仪检测分析。⑧收集细胞,采用美国BD LSRII型流式细胞仪上机分析细胞群,用FACS Diva6.1.3软件分析细胞群数据。检测的细胞亚群包括:CD3+T细胞、CD3+CD4-CD8-T细胞(double-negative T cells,DNTs)、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞。

1.3 统计学分析

采用Shapiro-Wilk检验和Levene检验评估连续变量分布的正态性和方差齐性。如满足正态分布,采用均值±标准差进行统计描述,并采用Student’st检验分析两组变量之间的差异;如不符合正态分布,采用中位数(四分位数间距)进行统计描述,采用非参数检验进行组间比较。P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 T淋巴细胞亚群在大动脉粥样硬化性和小动脉闭塞性卒中患者外周血中的百分比差异

研究结果表明CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞以及CD3+CD4-CD8-T细胞在大动脉粥样硬化性卒中患者和小动脉闭塞性卒中患者外周血中百分比间的差异无统计学意义(均P>0.05,见图1)。但是CD3+CD8+T细胞在小动脉闭塞性卒中患者外周血中的百分比明显高于大动脉粥样硬化性卒中患者外周血中的百分比,两组间差异具有统计学意义(t=2.295,P=0.027,见图1)。

SSC:侧向角散射;FSC:前向角散射;CD:白细胞分化抗原图1 不同亚型T细胞在缺血性脑卒中患者急性期外周血中的比例Figure 1 The proportion of different subtypes of T cells in peripheral blood of patients with acute ischemic stroke

2.2 性别及糖尿病对T淋巴细胞亚群在患者外周血中分布的影响

临床资料分析显示大动脉粥样硬化组患者中女性发病比例和糖尿病发病比例高(见表1)。因此本研究进一步对比了男性患者组与女性患者组外周血中CD3+CD8+T细胞的百分比,结果显示两组间的差异无统计学意义(t=0.908,P=0.370,见图2)。为了排除糖尿病对研究结果的影响,课题组在研究中还对比了糖尿病组和无糖尿病组患者外周血中CD3+CD8+T细胞的百分比,结果显示两组间的差异无统计学意义(t=0.768,P=0.447,见图2)。为了减少性别对CD3+CD8+T细胞在外周血中分布的影响,所有女性患者被去除后,对比两组间男性患者外周血中CD3+CD8+T细胞的百分比差异,结果显示小动脉闭塞性卒中患者外周血中的百分比明显高于大动脉粥样硬化性卒中患者外周血中的百分比,两组间差异具有统计学意义(t=2.214,P=0.035,见图2)。

图2 CD3+CD8+T细胞在不同人群缺血性脑卒中患者急性期外周血中的百分比Figure 2 Percentage of CD3+CD8+T cells in peripheral blood of patients with acute ischemic stroke in various populations

3 讨论

缺血性脑卒中因其发病原因不同所致预后结局也有所差别,目前临床推荐根据不同病因为患者提供确切的治疗方式[11]。因此明确不同亚型脑卒中发病机制间的差异是目前临床面对的一项主要问题。作为两种最主要的脑卒中类型,大动脉粥样硬化性卒中和小动脉闭塞性卒中成为目前病因学研究的重点。

颅内外血管的血栓形成是大动脉粥样硬化性脑卒中发病的主要原因,可造成颅内外血管供血不足,从而导致脑细胞代谢功能障碍,并引起相应供血区脑组织发生炎症反应,最终造成神经细胞的坏死和凋亡[12]。小动脉闭塞性卒中的发病多与长期高血压对血管的损伤有关,长期高血压引起小动脉壁玻璃样变性、内膜增生硬化、动脉壁局部结构紊乱,逐步造成相应脑功能区供血障碍、细胞坏死、炎症反应发生,并最终导致脑卒中的发生[13]。因此大动脉粥样硬化性卒中和小血管闭塞性卒中在发病机制上具有一定的差异。

免疫反应在脑卒中急性期组织损伤及后期组织修复过程中发挥重要作用。大量动物实验研究均表明,在缺血性脑卒中发病早期即出现明显的免疫反应,在脑缺血区域可检测到T淋巴细胞、单核细胞的过度募集,这些免疫细胞可通过刺激炎症因子的产生和细胞毒性蛋白酶的分泌导致神经组织的损伤[14]。目前研究发现由于不同病因导致的脑卒中病理过程有一定的差异,因此不同病因的脑卒中患者的免疫反应也有差别[15]。

T淋巴细胞作为主要的免疫细胞,参与脑卒中急性期的组织损伤过程。既往科学研究发现,在脑卒中患者急性期,40%侵入的T淋巴细胞为CD4+辅助性T细胞(CD3+CD4+T淋巴细胞),30%为CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+T淋巴细胞)[13]。CD4+T淋巴细胞通过介导白介素、肿瘤坏死因子等炎症因子的产生诱发脑组织的损伤[7,16]。细胞毒性CD8+T淋巴细胞通过释放细胞毒性蛋白酶参与神经元损伤的病理过程[17]。此外Meng Hailan课题组[18]研究发现,CD3+CD4-CD8-T淋巴细胞通过调节小胶质细胞介导的炎症反应参与了脑卒中发病过程中的脑组织损伤。

在本研究中,课题组应用流式细胞技术分析不同亚型缺血性脑卒中患者急性期外周血中T淋巴细胞的分布。结果表明CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞以及CD3+CD4-CD8-T细胞在大动脉粥样硬化性卒中患者和小动脉闭塞性卒中患者外周血中的百分比无明显差异。但是CD3+CD8+T细胞在小动脉闭塞性卒中患者外周血中的百分比明显高于大动脉粥样硬化性卒中患者外周血中的百分比,两组间差异具有统计学意义。此结果提示,细胞毒性CD3+CD8+T淋巴细胞在小动脉闭塞性卒中患者急性期外周血中被更多活化。此外,有研究发现当脑组织损伤时,在外周血管腔内和周围间隙有明显的CD3+CD8+T细胞的聚集[19]。这一现象可能与CD3+CD8+T淋巴细胞在小动脉闭塞性脑卒中患者急性期外周血中表达增加有关。由于细胞毒性CD8+T淋巴细胞主要通过释放细胞毒性蛋白酶参与神经组织的损伤,在未来研究中应该进一步检测细胞毒性蛋白酶在小动脉闭塞性脑卒中发病过程中作用。

既往有研究提出随着年龄增加,人群大动脉粥样硬化负担加重[20]。绝经后女性动脉粥样硬化斑块破裂风险增加,造成急性血管栓塞风险增高[21]。并且高龄患者发生糖尿病的风险增加[22]。在纳入研究的患者中,临床资料也显示大动脉粥样硬化组患者年龄较大,女性患者比例和糖尿病患者比例也较高。为了进一步验证CD3+CD8+T细胞在小动脉闭塞性卒中患者和大动脉粥样硬化性卒中患者外周血中的百分比差异,本研究分析了男性患者与女性患者外周血中CD3+CD8+T细胞的百分比,并且对比了糖尿病组和无糖尿病组患者外周血中CD3+CD8+T细胞的百分比,结果均提示组间无统计学差异。为了减少混杂因素影响CD3+CD8+T细胞在外周血中的表达,所有女性患者被去除后,再次对比了两组男性患者外周血中CD3+CD8+T细胞的百分比差异,结果提示小动脉闭塞性卒中患者外周血中的百分比明显高于大动脉粥样硬化性卒中患者外周血中的百分比,两组间差异具有统计学意义。这一结果提示CD3+CD8+T细胞在小动脉闭塞性卒中患者外周血中的分布增加在男性患者人群中更加明显。

4 结论

与大动脉粥样硬化性卒中患者相比,在小动脉闭塞性卒中患者急性期外周血中CD3+CD8+T淋巴细胞被更多活化,在缺血性脑卒中患者预后分析和治疗中应考虑到不同病因诱发的免疫反应间的差异。但是本组研究样本量偏小,并且为单中心病例研究,可能存在系统性误差,在未来研究中,更多中心患者的数据应该被纳入用于进一步的验证。