LINC01359在颅内动脉瘤患者血清中的表达及对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

印辰宇,季爱平,季海明,刘艺春,杨海峰

(1江苏省泰兴市人民医院神经外科,泰兴 225400;2华中科技大学附属同济医院神经外科;*通讯作者,E-mail:hfwhstongji2016@126.com)

颅内动脉瘤主要发生在颅内动脉分叉部位,是动脉血管壁由于血管平滑肌细胞凋亡引起的瘤样凸起[1,2]。动脉瘤破裂是蛛网膜下腔出血的主要病因,患者死亡率较高且预后较差[3,4]。探究动脉瘤的发生和发展机制,对预防和治疗动脉瘤至关重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的无编码功能的单链RNA,近年来动脉瘤的分子研究发现lncRNA与动脉瘤的发病密切相关[5]。lncRNA通过调节基因表达,影响血管平滑肌细胞的功能,介导动脉瘤的发生和发展[6]。同时,血清中特异性表达的lncRNA可作为动脉瘤形成的分子标志物[7]。LINC01359为lncRNA之一,存在于人血清中,可能成为肝癌非侵袭的标志物[8]。然而,LINC01359与动脉瘤的关系尚不清楚。本研究旨在分析LINC01359在动脉瘤患者血清中的表达水平,探究LINC01359对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及可能的分子调节机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株和试剂

人血管平滑肌细胞(HVSMC)购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。含有si-LINC01359序列的人重组慢病毒载体MCS-CMV-si、空载病毒MCS-CMV、LINC01359野生型及突变型重组双荧光素酶报告载体(LINC01359-WT、LINC01359-Mut)、miR-504-5p模拟物及对照物,购自上海吉凯生物技术有限公司。DMEM培养基、胎牛血清购自美国GIBOCO公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒和MTS试剂盒购自美国Promega公司。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购于日本Takara公司。Annexin Ⅴ/7-AAD双染法检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。一抗(Bak、β-actin、Caspase-9、Bcl-xL和Bcl-w)购于美国Abcam公司。

1.2 临床资料

纳入2019年7月至2021年4月间江苏省泰兴市人民医院神经外科诊治的颅内动脉瘤患者40例,其中男27例,女13例,年龄43-73岁,平均(61.35±15.52)岁;同期收集40例本医院体检中心无颅内动脉瘤者为健康组,其中男21例,女19例,年龄48-79岁,平均(66.18±12.56)。颅内动脉瘤患者均经数字减影血管造影确诊。本研究经本医院伦理委员会批准,患者和健康体检者均签署知情同意书。

1.3 细胞培养和慢病毒感染

常规复苏HVSMC细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养(37 ℃、5% CO2)。将对数生长期的HVSMC细胞接种至6孔细胞培养板,设置感染复数(MOI=80),分别感染重组慢病毒载体MCS-CMV-si(si-LINC01359组)或空载病毒MCS-CMV(空白对照组)。感染后96 h,荧光显微镜评估转染效率。

1.4 qRT-PCR检测LINC01359和miR-504-5p的表达水平

TRIzol法提取血清或者细胞总RNA,逆转录合成cDNA。建立qRT-PCR反应体系,循环扩增30次。引物序列如下,miR-504-5p正向:5′-TCTACACAGGTTGGGATCGG-3′,反向:5′-CGGGACAAGTGCAATACCATA-3′;U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。GAPDH正向:5′-GTCATCCCTGAGCTGAACGG-3′,反向:5′-CCACCTGGTGCTCAGTGTAG-3′;LINC01359正向:5′-TGGCTATTTCAGGTCCCTTG-3′,反向:5′-TGAGCTGAGATCATGCAACC-3′。LINC01359表达水平以GAPDH为内参,miR-504-5p表达水平以U6为内参。所得循环值经2-ΔΔCt法计算LINC01359和miR-504-5p表达水平。

1.5 MTS法检测细胞活力

取空白对照组和si-LINC01359组对数生长期HVSMC细胞,以约5×103个细胞/孔接种于96孔板,每组5个平行复孔。加入30 μl/孔的MTS试剂,培养箱内静置3 h,调节酶标仪波长为490 nm,读取每孔光密度(OD)值,取平均值。分别在24,48,72,96 h用MTS法检测细胞活力。

1.6 Annexin Ⅴ/7-AAD双染法检测细胞凋亡率

胰蛋白酶消化收集空白对照组和si-LINC01359组对数生长期的HVSMC细胞,PBS溶液洗3次,加入150 μl结合缓冲液重悬,加入10 μl Annexin Ⅴ-PE溶液混匀,加入10 μl 7-AAD溶液混匀,避光孵育20 min。加入200 μl结合缓冲液,采用流式细胞仪分析空白对照组和si-LINC01359组细胞凋亡变化。

1.7 生物信息学方法和双荧光素酶报告基因实验预测和验证LINC01359的靶基因

通过生物信息学数据库Starbase预测LINC01359的潜在作用靶点。分别转染LINC01359-WT、LINC01359-Mut与miR-504-5p模拟物或miR-504-5p对照物至HVSMC细朎,共转染48 h。通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测每组HVSMC细胞的相对荧光素酶活性。

1.8 Western blot法检测凋亡相关蛋白含量

通过细胞裂解液提取空白对照组和si-LINC01359组对数生长期细胞总蛋白,每组取30 μg体系在十二烷基聚丙烯酰胺凝胶中电泳,硝酸纤维素膜转膜,在6%脱脂牛奶中封闭3 h。以1 ∶2 000的比例稀释一抗,4 ℃孵育16 h,在37 ℃下二抗(1 ∶7 000稀释比例)孵育3 h。采用增强型化学发光试剂显影,在凝胶成像仪中成像并拍照。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 动脉瘤患者血清中LINC01359表达水平

qRT-PCR结果显示,动脉瘤患者和健康组血清中LINC01359相对表达分别为7.76±1.17和0.95±0.27,动脉瘤患者血清LINC01359表达水平较健康对照显著升高(P<0.01,见图1)。

与健康组比较,**P<0.01图1 动脉瘤组患者和健康组血清中LINC01359的相对表达Figure 1 The relative expression of LINC01359 in the serum of patients with aneurysm and healthy controls

2.2 重组慢病毒载体在HVSMC细胞中的绿色荧光蛋白表达及感染效率

将重组慢病毒载体感染HVSMC细胞,荧光显微镜下观察每组细胞的荧光表达,绿色荧光代表感染成功(见图2)。空白对照组和si-LINC01359组培养基中LINC01359相对表达分别为5.53±0.37和1.09±0.15,差异有统计学意义(P<0.01),说明构建的重组慢病毒载体MCS-CMV-si能够抑制LINC01359表达。

图2 空白对照组和si-LINC01359组荧光检测Figure 2 Fluorescence staining in blank control group and si-LINC01359 group

2.3 低表达LINC01359对HVSMC细胞增殖的影响

MTS法结果显示,各组HVSMC细胞在处理后48,72,96 h,si-LINC01359组的OD值明显低于空白对照组(P<0.05,见图3),说明低表达LINC01359能够有效抑制HVSMC细胞的增殖。

2.4 低表达LINC01359对细胞凋亡率的影响

流式细胞仪检测HVSMC细胞凋亡率显示,si-LINC01359组和空白对照组HVSMC细胞凋亡率分别为(21.86±4.97)%和(54.18±4.96)%,si-LINC01359组较空白对照组细胞凋亡率明显减低(P<0.01,见图4)。

与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01图3 MTS法检测各组HVSMC细胞增殖率的改变Figure 3 Proliferation rate of HVSMCs in each group detected by MTS method

图4 Annexin Ⅴ/7-AAD双染法检测各组细胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate in each group detected by Annexin Ⅴ/7-AAD double staining method

2.5 LINC01359靶基因分析和双荧光素酶报告基因实验

通过生物信息学数据库Starbase分析显示LINC01359的潜在靶基因可能是miR-504-5p(见图5)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,共转染LINC01359-WT和miR-504-5p模拟物的细胞相对荧光素酶活性较共转染LINC01359-WT和miR-504-5p对照物的相对荧光素酶活性降低(0.29±0.03vs1.07±0.17,P<0.01),而共转染LINC01359-Mut和miR-504-5p模拟物的细胞相对荧光素酶活性较共转染LINC01359-Mut和miR-504-5p对照物的差异无统计学意义(1.10±0.16vs1.03±0.10,P>0.05)。

图5 LINC01359与miR-504-5p的结合位点Figure 5 The binding site of LINC01359 and miR-504-5p

2.6 低表达LINC01359对HVSMC细胞中miR-504-5p表达的影响

qRT-PCR结果显示,si-LINC01359组HVSMC细胞miR-504-5p相对水平高达6.26±0.81,而空白对照组HVSMC细胞miR-504-5p相对表达仅1.03±0.27,即低表达LINC01359可上调HVSMC细胞miR-504-5p相对表达(P<0.01)。

2.7 低表达LINC01359对凋亡相关蛋白含量的影响

Western blot结果显示,与空白对照组相比,低表达LINC01359的细胞中抗凋亡因子Bcl-xL和Bcl-w蛋白表达增多,促凋亡因子Bak和Caspase-9蛋白表达降低(见图6)。

图6 Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达Figure 6 Expression of apoptosis-related proteins detected by Western blot

3 讨论

血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞,在维持血管的张力和调节血管的重塑方面发挥重要作用[9]。血管平滑肌细胞的凋亡,引起血管内皮功能破坏,是动脉瘤形成的关键因素[10]。lncRNA表达异常是介导血管平滑肌细胞功能障碍,诱发动脉瘤发病的关键因子[11]。Xu等[12]研究发现,颅内动脉瘤患者的血液中lncRNA HIF1A-AS1表达水平上调,其表达水平与颅内动脉瘤呈正相关,lncRNA HIF1A-AS1过表达抑制血管平滑肌细胞的增殖。Man等[13]研究发现,血清lncRNA GASL1表达下调可有效区分颅内动脉瘤患者与健康志愿者,lncRNA GASL1过表达促进人血管平滑肌细胞增殖并下调转化生长因子-β1的表达。最近研究表明,LINC01359在肝癌患者血清中表达显著上调,是肝癌诊断和进展的生物标志物[8]。但LINC01359是否能够影响动脉瘤的形成并不明确。

本研究结果显示,动脉瘤患者血清中LINC01359表达明显高于健康体检者,LINC01359可能成为动脉瘤的血清标志物,其在动脉瘤的形成过程中可能发挥负面效应。血管平滑肌细胞的增殖与凋亡的平衡对维持血管内皮功能的稳定具有重要意义,调控血管平滑肌细胞的增殖和凋亡是研究动脉瘤预防、诊疗和预后的有效方法[14,15]。本研究通过慢病毒感染敲低LINC01359表达,LINC01359低表达能够有效抑制HVSMC细胞的凋亡并促进其增殖。lncRNA通过与靶基因微小RNA(miRNA)结合配对,负向调控靶基因miRNA的表达,参与血管平滑肌细胞的凋亡、增殖等活动[16,17]。本研究通过Starbase数据库预测,LINC01359的靶基因miRNA可能是miR-504-5p。双荧光素素酶报告基因证实LINC01359可结合配对miR-504-5p。已有的研究[18]发现,miR-504-5p在动脉瘤患者的血管平滑肌细胞中的表达降低,miR-504-5p过表达显著上调抗凋亡因子的表达、下调促凋亡因子的表达,发挥明显的抗凋亡作用,同时miR-504-5p可促进血管平滑肌细胞的增殖。本研究显示,抑制LINC01359表达后,miR-504-5p的表达显著增加,表明LINC01359通过调节miR-504-5p表达发挥作用。本研究Wes-tern blot显示,低表达LINC01359的细胞中抗凋亡因子Bcl-xL和Bcl-w蛋白表达增多,促凋亡因子Bak和Caspase-9蛋白表达降低,进一步证实了HVSMC细胞中LINC01359的抗凋亡作用。

综上所述,本研究证实动脉瘤患者血清中LINC01359表达显著升高,LINC01359高表达与动脉瘤的形成密切相关。敲低LINC01359通过有效提高miR-504-5p的表达水平,促进HVSMC细胞的增殖并抑制HVSMC细胞的凋亡发生。LINC01359在血管平滑肌细胞中的功能研究为动脉瘤的发生机制研究提供了新的思路。