双酶法水解罗非鱼下脚料制备降血糖肽的工艺研究

赵 阔，罗 山，王 涛，陈 艳，梁爱文，邹 易，郑联合

（海南省粮油科学研究所，海南 琼海571400）

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种由于胰岛素生物作用受损或分泌不足而引起血液中葡萄糖水平慢性增高的代谢疾病，持续的高血糖和长期代谢紊乱，会引起肾脏、眼睛、足部、神经、心血管及其他组织器官受损，严重时容易引发酮症酸中毒、高血糖高渗性昏迷等急性并发症。近年来，由于生活水平不断提高，饮食结构改变，生活节奏加快，精神压力增大，同时机械化、智能化的发展，使得人类劳动强度不断降低，全球糖尿病发病率增长迅速，且发病人群也逐渐趋于年轻化[1-3]。最新数据显示，我国是全球糖尿病患者人数最多的国家，患者约1.14亿人，约占全球糖尿病人总数的33%[4]。糖尿病目前没有根治方法，最有效的方式是靠饮食、运动和药物联合控制血糖水平，应用最普遍、药效最明显的主要是胰岛素、磺酰脲类和双胍类降糖药物，但存在一定副作用[5]。

中医学将糖尿病归属“消渴病”范畴，历代医著中记载了许多治疗消渴病的良药，我国民间也一直流传着苦瓜、南瓜、洋葱、玉米须等食疗偏方。近代天然产物及中医药学的深入研究，揭示了许多中草药、食品中具有降血糖功效的成分及降糖机理，按化学结构可分为多糖类、黄酮类、生物碱类、皂苷类、萜类、共轭亚油酸、多肽类等。降血糖肽是一类能够降低血糖的多肽活性物质，来源于食物蛋白，安全性高、无毒副作用，适合长期服用，除此之外，降血糖肽本身是一种多肽，具有较高的营养价值。因此，降血糖肽无论在功能性食品还是在医药产品开发方面都具有广泛的应用前景[6-8]。

罗非鱼（Tilapia）也称福寿鱼、非洲鲫鱼，肉质厚、白洁无刺、味道鲜美，是联合国粮农组织极力推荐养殖的优良鱼种，现已成为世界性的养殖鱼类，养殖范围覆盖100多个国家和地区，年产量超过300万t。近10年来我国的罗非鱼产量以平均每年9%左右的速度递增，居世界第1位。《中国渔业统计年鉴2019》数据显示，2018年我国罗非鱼淡水养殖产量为162.5万t，同比2017年的158.5万t增长4万t，是我国水产加工量最多的鱼种[9]。罗非鱼加工主要制成鱼排、鱼片、鱼条等，鱼头、尾、鳍、鳞、皮、内脏、残肉等沦为下脚料，总质量约占整条鱼的60%[10-11]，目前仅有部分被加工成鱼粉添加到饲料中，大部分被丢弃，造成蛋白质资源的浪费。笔者曾以罗非鱼下脚料为原料制备过降血压肽[12]，试验开展双酶法水解罗非鱼下脚料制备降血糖肽的工艺研究，以期为罗非鱼下脚料的高值化综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

罗非鱼下脚料：新鲜罗非鱼洗净后剔除鱼肉，剩余物于-20℃下冻存，试验时在4℃下解冻。

α-葡萄糖苷酶、对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），美国Sigma公司提供；碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

S-D200型高效组织捣碎机，上海模具厂产品；UV-8000s型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限责任公司产品；Sigma 3-30k型高速冷冻离心机，上海誉鑫科技有限公司产品；HDK-6型数显恒温磁力搅拌水浴锅，常州德科仪器制造有限公司产品；RG-18型磁力搅拌器，上海玛尼仪器设备有限公司产品；QDN-ll型全自动凯氏定氮仪，杭州汇尔仪器设备有限公司产品；PB-10型pH计，德国赛多利斯科学仪器有限公司产品；SB5200DTD型超声波清洗机，宁波新艺生物科技有限公司产品；AY220型电子天平，日本岛津产品；UPN-11-10T型超纯水制造系统，四川优普超纯科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 罗非鱼下脚料酶解

将罗非鱼下脚料剪成小块，加入蒸馏水调节底物浓度，用高速组织捣碎机绞碎，调节所需pH值，在设定温度下加入蛋白酶水解一定时间，沸水浴灭活10 min，冷却后离心10 min，离心机转速3 500 r/min，中间部分的澄清液即为罗非鱼水解液。

1.3.2 双酶复合水解方案确定[13-14]

选取5种常用蛋白酶（碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶），结合厂家提供的最适酶解条件，分别对罗非鱼下脚料进行水解，比较5种蛋白酶水解液的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率，筛选出碱性蛋白酶和胰蛋白酶作为合适用酶。将筛选出的蛋白酶复合，复合方案包括双酶同步水解和双酶分步水解，具体实施方案见表1，比较各方案水解液的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率，确定双酶水解方案。

双酶复合水解罗非鱼下脚料方案见表1。

表1 双酶复合水解罗非鱼下脚料方案

1.3.3 双酶水解工艺优化

根据双酶复合水解方案，首先优化碱性蛋白酶的水解工艺参数，再以碱性蛋白酶水解产物为底物进行胰蛋白酶水解工艺优化。碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解工艺优化均在单因素试验基础上进行正交试验。

1.3.4 水解度测定方法

水解度（DH）指蛋白质分子发生水解反应后断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例，反映蛋白质的水解程度。

（1）氨基酸态氮（AAN）含量的测定（参照GB 5009.235—2016中比色法）。

（2）总氮含量的测定（参照GB 5009.5—2016中凯氏定氮法）。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法[15-17]

取2 mg/mL蛋白酶水解液100μL，加入0.16 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50μL，于37℃下水浴10 min后，加入2.5 mmol/L的底物PNPG（对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷）溶液50μL，在37℃下水浴15 min，随后立即加入1 mol/L的Na2CO3溶液100μL终止反应，测定波长405 nm处的吸光度A1，另取100μL磷酸盐缓冲溶液代替酶解液，测定其吸光度A0，再测定只有酶解液反应体系的吸光度A2，按下式计算抑制率：

2 结果与分析

2.1 双酶复合水解方案确定

根据蛋白酶筛选结果，将碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合后水解罗非鱼下脚料，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率为指标比较各方案水解效果。

双酶水解罗非鱼下脚料效果见图1。

图1 双酶水解罗非鱼下脚料效果

由图1可见，在6种水解方案中，双酶水解（方案1-4）效果优于单酶水解（方案5、6），且差异显著（p<0.05），分析原因可能是双酶复合作用，改善了单一蛋白酶的专一性，作用位点增多加速了罗非鱼下脚料的水解，产生了更多的具有降血糖活性的物质。方案1-4中，双酶分步水解（方案3、4）效果优于同步水解（方案1、2），可能是因为2种酶的最适条件不同，同步水解方案试验条件难以将蛋白酶的活性全部发挥出来，而双酶分步水解虽然操作起来稍微麻烦一点，但是能确保2种蛋白酶均在最适条件下进行水解，从而提高了水解度和产物α-葡萄糖苷酶抑制率。双酶分步水解（方案3、4）中，方案3水解效果优于方案4，分析原因可能是碱性蛋白酶的水解能力强于胰蛋白酶，因此第一步水解用碱性蛋白酶水解先破坏罗非鱼下脚料中蛋白质的组织机构，第二步用胰蛋白酶进一步水解，产生更多具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的物质。由此确定，方案3为最优方案。

2.2 双酶水解工艺参数优化

双酶水解采用分步水解方式，第一步，碱性蛋白酶水解；第二步，胰蛋白酶水解。其中，碱性蛋白酶水解工艺优化，以温度、加酶量、pH值和底物质量分数为影响因素，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，分别进行单因素试验和正交试验，最终确定碱性蛋白酶水解罗非鱼加工下脚料的最佳工艺参数为温度50℃，加酶量10 000 U/g，pH值9.5，底物质量分数6%，此工艺条件下罗非鱼下脚料水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率分别为28.19%和30.12%。

胰蛋白酶水解工艺，单因素优化试验结果表明，胰蛋白酶水解的最佳温度为35℃，最佳加酶量为10 000 U/g，最佳水解时间为1.5 h，最佳pH值为8，在此基础上，以温度、加酶量、时间和pH值为影响因素，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，开展L16（45）正交试验。

胰蛋白酶水解正交试验结果见表2，胰蛋白酶水解正交试验结果方差分析见表3。

表2 胰蛋白酶水解正交试验结果

表3 胰蛋白酶水解正交试验结果方差分析

由表2可知，影响水解度的因素主次顺序为A>D>B>C，最优组合为A3B2C2D3，而影响抑制率的因素主次顺序为C>A>B>D，最优组合为A3B2C3D2。2个组合的差别在于因素C（时间）、因素D（pH值）各自是取水平二还是水平三。根据方差分析结果（表3），因素C（时间）对抑制率有显著影响，因素A（温度）对水解度影响显著，因素D对水解度和抑制率影响均无显著影响，因此将反应时间优化为100 min，将pH值优化为8.0，优化后的蛋白酶水解工艺组合为A3B2C3D2，即温度37℃，加酶量10 000 U/g，时间100 min，pH值8。在最适组合条件下进行验证试验，罗非鱼下脚料水解度、抑制率分别为48.26%和41.46%，与单酶（碱性蛋白酶）水解相比，水解度提高了20.07%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了11.34%。

3 结论

碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶水解罗非鱼下脚料的最佳方案是分步水解，水解顺序为碱性蛋白酶、胰蛋白酶，优化后的水解工艺为先在碱性蛋白酶在温度50℃，加酶量10 000 U/g，pH值9.5、底物质量分数6%条件下水解；再在胰蛋白酶在温度37℃，加酶量10 000 U/g，pH值8条件下水解100 min。此工艺参数下罗非鱼下脚料水解度、水解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率分别为48.26%和41.46%，与单酶（碱性蛋白酶）水解相比，水解度提高了20.07%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了11.34%。