好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆产类胡萝卜素的研究

吴永存，李兰欣，辛嘉英

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150028）

类胡萝卜素（Carotenoid）是一类重要天然色素的总称，主要存在于动物、高等植物、真菌等色素中，动物体本身不能合成类胡萝卜素，必须通过外界获得。其中，β-类胡萝卜素具有十分显著的抗氧化和增强免疫活性的作用[1]；类胡萝卜素属于脂溶性维生素，是一种天然的着色剂，对改善畜禽肉、蛋、乳、皮毛等品质具有重要作用[2]；类胡萝卜素还可以提高动物的免疫能力和抗应激能力，对动物的正常生长发育有重要意义。

好食脉孢菌（Neurospora sitophila）又名为链孢霉或红色面包霉，经过FDA认证其不产生毒素，且对基质适应性广，可以在豆渣、酒糟等农副产品上生长[3]。相关研究表明，好食脉孢菌是一种对营养要求简单、生长速度快、菌体营养丰富、无毒性和致病性的好氧菌。可以在固体基质上生长繁殖，其营养菌丝会深入到基质中吸收养分，气生菌丝向空气中伸展并发育繁殖菌丝产生孢子。经过好食脉孢菌发酵后得到的产物，营养价值及食用口感等方面显著提高[4]，并且好食脉孢菌酶系广泛，主要由纤维素酶等组成，有利于对粗纤维和木质素进行降解，发酵后得到的产物没有不良气味[5]，可用于饲料的发酵。

红酵母（Rhodotorula）属隐球酵母科，细胞为圆形、卵形或长杆形，对环境的适应能力强，最显著的特点是能生成天然类胡萝卜素。近年来，红酵母被广泛应用到发酵领域，对红酵母发酵产类胡萝卜素方面的研究也被越来越多的人重视。红酵母的生长和繁殖能力强、对生长环境条件要求较低，并且菌体营养丰富[6]。由于红酵母的这些优良特性，红酵母被广泛应用于食品、化工、环境保护、动物饲养等方面[7]，而红酵母的主要代谢产物为类胡萝卜素[8]。

玉米秸秆的粗纤维含量高、蛋白质含量低、木质素与蜡质在秸秆中互相缠绕，形成难以破坏的结构，造成直接饲喂秸秆营养价值低、饲喂效果差，并且很少被用于直接饲喂动物，只有极少量的秸秆被利用，大量秸秆都以焚烧的方式进行处理[9]。燃烧秸秆对空气质量产生较大的影响，使季节性雾霾加重。

相关研究表明，以豆类、水果等原料加工后产生的残余物，通过好食脉孢菌和红酵母协同发酵产类胡萝卜素，并使糟渣粗纤维含量降低，蛋白质含量身高，从而提高糟渣的营养价值与饲用效果[10]。玉米秸秆发酵后，营养成分显著提高，口感也会提高[11]。发酵过程中可加入麸皮，麸皮可促进需氧菌的生长[12]。以玉米秸秆为发酵原料，麸皮作为碳源、干豆渣作为氮源，利用好食脉孢菌和红酵母固态发酵玉米秸秆，通过优化培养基条件和发酵条件，使发酵后的秸秆变得松软，可促进动物的食欲、减轻动物消化的负担，在类胡萝卜素产量提高的同时，提高玉米秸秆的利用价值，为工厂化生产功能性玉米秸秆饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米秸秆，购自黑龙江省绥化市兰西县；麸皮、干豆渣、丙酮。

DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；LDZX-50KBS型立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械场产品；HZQ-D型恒温振荡器，中国·哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；DL-CJ-2NDI超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；UV-2550型紫外-可见光光度计、TGL-16G型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品。

1.2 菌种与培养基

1.2.1 菌种

好食脉孢菌、红酵母（食品级实验室提供）。

1.2.2 培养基

（1）好食脉孢菌的培养。将新鲜土豆切成2 mm左右薄片，称取50 g于沸水中煮5 min，自然冷却后用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖和琼脂各4 g，加蒸馏水定容至200 mL，分别装入三角瓶中，经121℃湿热灭菌20 min后摇匀摆斜面，待冷却后向培养基斜面接种好食脉孢菌，于28～30℃下恒温培养3 d，待培养基长满金黄色孢子后备用。

（2）红酵母的培养。准确称取1.5 g葡萄糖，0.5 g蛋白胨，2.0 g琼脂，0.054 g硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾各0.05 g，加入100 mL蒸馏水，分别装入三角瓶中，经121℃湿热灭菌20 min后摇匀摆斜面，凝固3～4 h，向培养基偏上位置接种红酵母菌，于28～30℃下恒温培养3 d，待培养基长满红色孢子后备用。

（3）固态发酵。向250 mL锥形瓶中加入10 g秸秆粉，其他原料与配比依据试验确定，将锥形瓶用8层纱布和4层报纸密封，放入高压蒸汽灭菌锅中进行121.0℃灭菌1 h。置于超净工作台，冷却后加入好食脉孢菌（接种量为10%）和红酵母菌（接种量为10%），搅拌均匀于培养箱中进行发酵培养。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

以类胡萝卜素产量为指标，首先确定培养基条件，包括培养基初始pH值、水分含量、碳源用量、氮源用量、无机盐添加量和培养基装量。

小麦麸皮是小麦加工过程中的主要农副产品，富含粗蛋白、糖分（麦芽糖、淀粉等）和维生素。试验采用麸皮作为碳源，用量为1，2，3，4，5 g，既为微生物发酵提供营养物质又实现了农副产品麸皮的充分利用。

干豆渣是豆制品加工生产过程中产生的副产品，其中大豆蛋白、脂肪等营养成分较丰富，可以为微生物合成含氮物质提供氮源，并且为菌体生长提供营养物质，实现干豆渣的有效利用，所以试验用干豆渣作为氮源，用量为1，2，3，4，5 g。

无机盐作为培养基中微生物生长的营养物质之一，维持好食脉孢菌和红酵母的生长和新陈代谢，所以试验选择无机盐MgSO4加入到培养基中，单因素Mg2+添加量为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%。

1.3.2 发酵产物处理及产量计算

称取空白组秸秆粉均匀铺在培养皿中，再称取3份相同质量的试验组秸秆粉于培养皿中，将4份培养皿放入45℃恒温干燥器内，干燥至恒质量。

将干燥结束的培养皿取出，准确称取1 g干燥的秸秆粉和1 g石英放入研钵内研磨至粉碎，将粉碎后的秸秆粉末放入锥形瓶中，并加入15 mL丙酮，盖紧，放至振荡器内振荡35 min。振荡后取出，吸取其中的液体于离心管内，然后将离心管放入离心机中离心15 min。离心结束后，吸取离心管内上清液于比色皿中，用未接好食脉孢菌和红酵母菌的秸秆培养基作为对照，于波长460 nm处测定吸光度，根据计算公式得出类胡萝卜素的质量，并记录数据。

式中：B——单位质量发酵玉米秸秆中类胡萝卜素质量，μg/g；

Aλmax——最大吸收波长460 nm处的吸光度；

D——测定试样的稀释倍数；

V——提取类胡萝卜素所用丙酮溶剂体积，mL；

m——干玉米秸秆的质量，g；

0.16——类胡萝卜素的摩尔消光系数。

2 结果与分析

2.1 培养基条件优化

2.1.1 培养基初始pH值对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培养基水含量为55%，调节培养基pH值分别为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），在32℃下恒温培养96 h后，测定培养基初始pH值对类胡萝卜素产量的影响。

pH值对胡萝卜素产量的影响见图1。

图1 pH值对胡萝卜素产量的影响

由图1可知，固态发酵培养基的初始pH值对好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆生产类胡萝卜素有较大的影响，培养基pH值过高或过低时会降低微生物细胞对环境中营养成分的吸取能力或抑制菌体中某些酶的活性甚至导致其死亡[13]，从而使类胡萝卜素产量降低，在微酸的培养环境中类胡萝卜素产量较高，当培养基初始pH值约为5.5时是好食脉孢菌和红酵母发酵的最适生长pH值和最适生产pH值，类胡萝卜素产量最高，当pH值大于5.5后，pH值抑制菌体酶的活性，破坏微生物生化体系中各种生化反应的协调一致性，从而影响微生物细胞内的新陈代谢，导致其不能正常发酵秸秆，使类胡萝卜素产量降低。

2.1.2 水添加量对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培养基水添加量为55%，调节培养基pH值约为6，加入蒸馏水使培养基的水添加量分别为50%，55%，60%，65%，70%，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），在28℃恒温培养箱中培养96 h后，测定不同培养基水添加量下对类胡萝卜素产量的影响。

水添加量对胡萝卜素产量的影响见图2。

图2 水添加量对胡萝卜素产量的影响

由图2可知，固态发酵培养基水添加量对好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆有影响。水分是大部分微生物生长所必需的成分，好食脉孢菌和红酵母的生长繁殖及类胡萝卜素的形成都需要适宜的水分，对固态发酵培养基中水添加量的控制至关重要[14]。当培养基水添加小于60%时，水添加量较低使酶的活性受到抑制导致微生物生长不良，当培养基水添加量大于60%时会降低基质的疏松度，阻碍氧气的传递，影响好食脉孢菌和红酵母正常繁殖代谢，减弱了好食脉孢菌纤维素酶活性，使菌株不能正常分解秸秆，导致类胡萝卜素产量迅速降低。

2.1.3 碳源用量对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，分别加入麸皮1，2，3，4，5 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培养基水添加量为55%，调节培养基pH值约5.5，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），在28℃恒温培养箱中培养96 h后，测定不同麸皮用量对类胡萝卜素产量的影响。

碳源用量对胡萝卜素产量的影响见图3。

图3 碳源用量对胡萝卜素产量的影响

由图3可知，麸皮作为培养基的碳源成分，其用量过多或过少对类胡萝卜素的产量都有影响。当麸皮用量过少时培养基中的营养成分不充足，不能满足菌体的正常生长，使相关酶不能发挥作用；当麸皮用量过多时，霉菌菌丝生长旺盛，孢子产量降低，相当于发挥作用的菌株减少，从而导致类胡萝卜素产量降低，由图3可知麸皮最适用量为4 g。

2.1.4 氮源用量对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮2 g，分别加入干豆渣1，2，3，4，5 g，Mg2+添加量0.2%，培养基水添加量为55%，调节培养基pH值约为5.5，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），在28℃培养箱中培养96 h后，测定不同干豆渣用量对类胡萝卜素产量的影响。

氮源用量对胡萝卜素产量的影响见图4。

图4 氮源用量对胡萝卜素产量的影响

由图4可知，当干豆渣用量小于2 g时，有利于好食脉孢菌和红酵母的利用，有利于代谢产物的形成，当干豆渣用量大于2 g时，类胡萝卜素产量反而逐渐降低。由于干豆渣中的蛋白质等营养成分较为丰富，加入过多干豆渣使培养基中氮含量增加，霉菌生长旺盛，好食脉孢菌和红酵母生长的相关酶受到抑制作用，因此类胡萝卜素产量降低。

2.1.5 Mg2+添加量对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，培养基水添加量为55%，调节培养基pH值约为5.5，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），在28℃的恒温培养箱中培养96 h后，测定Mg2+添加量对类胡萝卜素产量的影响。

Mg2+添加量对胡萝卜素产量的影响见图5。

图5 Mg2+添加量对胡萝卜素产量的影响

由图5可知，Mg2+添加量对好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆的类胡萝卜素产量有一定影响。一定量的K+、Mg2+、Na+、Ca2+对类胡萝卜素产量有促进的作用[13]。马歌丽等人[14]在红酵母发酵生产β-类胡萝卜素培养基配方研究中得出适量的MgSO4能促进类胡萝卜素的积累；Mg2+对食脉孢霉固态发酵麸皮产类胡萝卜素有较强的促进作用[15]；当MgSO4添加量小于0.4%时，类胡萝卜素产量逐渐增加，因为在细胞生长过程中，Mg2+对细胞分裂和糖降解酶的活性有促进作用[16]。当Mg2+添加量为0.2%～0.4%时，类胡萝卜素产量与其呈正比关系，添加量为0.4%时类胡萝卜素产量最高。当添加量大于0.4%后，培养基环境的渗透压增高会降低酶的活性，使好食脉孢菌降解粗纤维能力下降，红酵母的生物活性也受到影响，从而导致类胡萝卜素产量降低。

2.1.6 培养基初始装量对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培养基水添加量为55%，调节培养基pH值约为5.5，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），培养基装量分别为12.5，13.0，13.5，14.0，14.5 g/mL，在28℃恒温培养箱中培养96 h后，测定不同培养基初始装量对类胡萝卜素产量的影响。

培养基装量对胡萝卜素产量的影响见图6。

图6 培养基装量对胡萝卜素产量的影响

由图6可知，类胡萝卜素的产量易受装瓶量的影响，好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆需要氧气，装瓶量主要影响培养基的溶氧量和营养成分含量，当培养基装量为12.5 g/250 mL时，类胡萝卜素产量最高，当装瓶量过少时，培养基中营养成分相对过少，不能满足好食脉孢菌和红酵母的正常生长繁殖；当装瓶量过大时，培养基中的溶氧量相对减少，从而抑制好食脉孢菌和红酵母正常代谢，使好食脉孢菌的纤维素酶活性降低，因此类胡萝卜素产量降低。

2.1.7 正交试验

以培养基水添加量（A）、麸皮用量（B）、干豆渣用量（C）、MgSO4添加量（D）为影响因素，以固态发酵后类胡萝卜素的产量为指标，在秸秆添加10 g，装量为12.5 g/250 mL，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），发酵温度28℃，发酵时间96 h的条件下，设计正交试验。

L9（34）正交因素与水平设计见表1，L9（34）正交试验结果见表2。

表1 L9（34）正交因素与水平设计

表2 L9（34）正交试验结果

由表2可知，4个因素对累胡萝卜素产量影响程度从大到小依次为C>A>D>B，即干豆渣用量>培养茎水添加量>MgSO4添加量>麸皮用量，最优水平为C2B3A2D2，即干豆渣用量3 g，麸皮用量4 g，水添加量60%，MgSO4添加量0.4%，此条件下的发酵试验测的类胡萝卜素产量为224.75μg/g。

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 接菌比例对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮4 g，干豆渣3 g，Mg2+添加量0.4%，培养基水添加量为60%，调节培养基pH值约为5.5，接种量为20%，接菌比例分别为好食脉孢霉∶红酵母=2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，在28℃的恒温培养箱中培养96 h后，测定不同比例接种量对类胡萝卜素产量的影响。

接种比对胡萝卜素产量的影响见图7。

图7 接种比对胡萝卜素产量的影响

由图7可知，不同比例的接种量对类胡萝卜素产量有一定影响，好食脉孢菌可以降解玉米秸秆中的粗纤维，当好食脉孢菌含量较低时玉米秸秆中的粗纤维很难被充分降解，使固态发酵程度不彻底从而影响类胡萝卜素的产量，当红酵母的接种量过低时，使红酵母发酵玉米秸秆产类胡萝卜素效果不明显，当2种菌的接种比例为1∶1时，好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆效果显著明显可以使类胡萝卜素产量提高。

2.2.2 培养温度对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮4 g，干豆渣3 g，Mg2+添加量0.4%，培养基水添加量为60%，调节培养基pH值约为5.5，接种量为20%（好食脉孢霉∶红酵母=1∶1）分别在24，28，32，36，40℃的恒温培养箱中培养96 h后，测定不同培养温度对类胡萝卜素产量的影响。

培养温度对胡萝卜素产量的影响见图8。

图8 培养温度对胡萝卜素产量的影响

由图8可知，温度在24～28℃时，类胡萝卜素的产量与温度呈正比关系，且在28℃时类胡萝卜素产量最高，但在28℃时类胡萝卜素产量下降明显且呈逐渐下降的趋势，因此可知，好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆时，最适温度一般在28℃左右，适宜的温度有利于微生物的生长繁殖和产物的合成，但过高会使微生物活性降低甚至死亡，导致相关酶的活力降低或丧失，使类胡萝卜素产量降低。

2.2.3 培养时间对类胡萝卜素产量的影响

向250 mL锥形瓶中加入秸秆粉10 g，麸皮4 g，干豆渣3 g，Mg2+添加量0.4%，培养基水添加量为60%，调节培养基pH值约为5.5，接种量为20%（好食脉孢霉∶红酵母=1∶1）在28℃的恒温培养箱中分别培养24，48，72，96，120 h后，测定不同培养时间对类胡萝卜素产量的影响。

培养时间对胡萝卜素产量的影响见图9。

由图9可知，在整个培养过程中，类胡萝卜素的产量呈上升趋势，在72～96 h时，类胡萝卜素产量增加速度最快，96 h后类胡萝卜素产量缓慢增加，这是因为随着发酵的进行，培养基中的营养物质逐渐被消耗，能为好食脉孢菌和红酵母提供的营养物质越来越少而导致其代谢缓慢，以至于类胡萝卜素生产的速率大幅降低，所以在发酵96 h后培养时间对类胡萝卜素产量影响不大。

图9 培养时间对胡萝卜素产量的影响

3 结论

对好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆产类胡萝卜素的培养条件进行了研究。通过单因素试验和正交试验表明，250 mL锥形瓶中加入秸秆10 g，麸皮4 g，干豆渣3 g，MgSO4添加量为0.4%，培养基初始pH值约为5.5，培养基含水量为60%，接种量为20%（好食脉孢菌∶红酵母=1∶1），在28℃恒温培养96 h，类胡萝卜素产量达到224.75μg/g。试验优化提高了好食脉孢菌和红酵母协同固态发酵秸秆的类胡萝卜素产量。

通过对好食脉孢菌和红酵母协同发酵秸秆前后状态的比较，发酵后的秸秆质地柔软且色泽金黄，有微微的醇香味，可以初步判断在发酵过程中产生了乙醇，为生产含有天然类胡萝卜素的功能性饲料奠定了基础。