原因不明复发性自然流产患者血清IL-10 水平变化及其与miR-513c-5p的调控关系

尹红，魏然，张振，朱肖肖，郭强，褚楚，付笑笑，赵霖，李霞

1 山东第一医科大学（山东省医学科学院）基础医学院，济南250062；

2 山东第一医科大学附属省立医院

复发性自然流产（RSA）是指与同一配偶发生两次或两次以上的自然流产，发病率为1%～5%，严重威胁女性生殖健康［1-2］。近50%的RSA 病因是未知的，被称为原因不明复发性自然流产（URSA）。从免疫学角度认为，正常妊娠类似于成功的同种异体移植，如果免疫耐受状态被破坏将导致流产发生［3-4］。随着生殖免疫学的发展，细胞因子在维持正常妊娠过程中发挥的作用备受关注。白细胞介素10（IL-10）是体内重要的调节性细胞因子，在维持机体内环境稳定及诱导免疫耐受过程中具有重要作用。研究发现，URSA 患者血清IL-10 水平低于正常妊娠妇女，提示IL-10 可能参与了URSA 的发生，但导致该现象的原因尚不清楚。微小RNA（miRNA）是一种内源性非编码RNA，可通过与mRNA 的3"非翻译区（3"UTR）结合以调控靶基因表达与功能，从而参与增殖、凋亡等多个生理过程。越来越多的研究发现，miRNA 参与了URSA 发生与发展，但尚不清楚其是否可通过调控IL-10 参与URSA 的发生。本研究通过检测URSA 患者外周血IL-10 及miR-513c-5p 水平变化，结合体外细胞实验，探讨miR-513c-5p对IL-10是否存在调控作用，从生殖免疫调控角度探究URSA 发病机制，为临床治疗提供新的靶点与依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 将2019 年1 月—2020 年1 月山东第一医科大学附属省立医院妇产科病房及门诊就诊的URSA 患者和正常早孕妇女作为研究对象，URSA患者及正常妊娠妇女纳入标准参照本课题组前期文献报道［5-6］。本研究共纳入URSA 患者（URSA 组）和正常早孕妇女（正常妊娠组）各30 例，URSA 组孕（7.5±1.2）周、年龄（27.2±4.1）岁，对照组孕（7.7± 1.1）周、年龄（26.9 ± 4.5）岁。两组孕周、年龄具有可比性。本研究经山东第一医科大学（山东省医学科学院）基础医学院（基础医学研究所）伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 标本采集与试剂准备 采集两组清晨空腹静脉血6 mL，离心分离血清用于ELISA 法检测IL-10蛋白，经淋巴细胞分离液试剂盒分离外周血单个核细胞（PBMC）用于qPCR 法检测miR-513c-5p 表达及IL-10 mRNA。实 验 试 剂：TRIzol Reagent、UItra-SYBR Mixture 均购于北京康为世纪生物科技公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 及HiScript ⅡQ RT Super Mix for qPCR Kit 均购于南京诺唯赞生物科技有限公司；293T 细胞购于南京科佰生物科技有限公司；Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；IL-10 ELISA 试剂盒购于杭州联科生物技术有限公司；人外周血淋巴细胞分离液试剂盒购于北京华越洋生物科技有限公司；miR-513c-5p 过表达（mimics）、抑表达（inhibitor）、阴性对照（NC）序列见表1；qPCR 引物及内参照U6逆转录引物由上海博尚生物技术有限公司设计合成，目的基因IL-10 qPCR 引物及内参照GAPDH 由上海吉玛公司设计合成，引物序列见表2；野生型与突变型IL-10 3"UTR 载体均由美国Promega公司设计合成。

表1 miR-513c-5p过表达、抑表达及其阴性对照转染物序列

1.3 外周血中IL-10蛋白及miR-513c-5p检测

1.3.1 IL-10蛋白检测 取离心所得血清，以ELISA法检测IL-10蛋白，严格按照说明书操作。使用酶标仪测定双波长（450 nm、630 nm）时的光密度（OD）值，依据标准品OD 值绘制标准曲线，按照OD450-OD630值计算IL-10蛋白浓度。

1.3.2 miR-513c-5p 检测 各组细胞总RNA 以TRIzol 法进行提取，RNA 浓度与纯度用紫外分光光度仪进行测定。按照诺维赞公司miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行miRNA 的cDNA 合成，选用UltraSYBR Mixture PCR 反应体系进行PCR扩增，选用U6作为内参，以2-ΔΔCt法计算miR-513c-5p相对表达量。

1.4 miR-513c-5p 与IL-10 关系的预测 选用Target Scan7.1 生物信息学软件，分析miR-513c-5p与IL-10 mRNA 3"UTR之间是否存在直接的结合。

1.5 miR-513c-5p 与IL-10 mRNA 3"UTR 结 合 位 点验证 以pmirGLO为载体构建包含结合位点的野生型及突变型IL-10 mRNA 3"UTR 质粒，然后转染至293T 细 胞，同 时 分 别 转 染miR-513c-5p mimics 及NC，检测双荧光素酶报告基因活性。

1.6 miR-513c-5p 调控IL-10 蛋白表达情况观察 将293T细胞分为过表达组、抑表达组与空白对照组，以Lipofectamine2000 分别转染miR-513c-5p mimics、inhibitor 及NC；24 h 后收集各组细胞，ELISA法检测培养上清液中的IL-10 蛋白，qPCR 法检测细胞中的IL-10 mRNA，检测与计算方法同1.3.1。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism Version 8统计软件。计数资料均以±s 表示，两组数据比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 IL-10 mRNA、miR-513c-5p及其对照基因的引物序列和产物片段长度

2 结果

2.1 正常妊娠组及URSA 组血清IL-10 蛋白及PBMC 中miR-513c-5p 表达水平比较 由表3 可见，URSA 组较正常妊娠组外周血IL-10 蛋白水平降低而miR-513c-5p表达升高（P均＜0.05）。

表3 两组血清IL-10蛋白及PBMC中miR-513c-5p表达比较（±s）

表3 两组血清IL-10蛋白及PBMC中miR-513c-5p表达比较（±s）

注：与正常妊娠组比较，*P＜0.05。

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2.2 miR-513c-5p 与IL-10 关系的生物信息学预测结果 由表4 可见，miR-513c-5p 与IL-10 mRNA 3"UTR 之间具有潜在的互补结合位点，提示miR-513c-5p可能通过结合IL-10 mRNA的3"UTR进而抑制其转录水平及蛋白表达。见表4。

表4 miR-513c-5p与IL-10 3´UTR结合位点的预测结果

2.3 miR-513c-5p 对IL-10 mRNA 3"UTR 荧 光 素 酶报告基因活性的影响 由表5 可见，转染miR-513c-5p mimics 可以降低野生型IL-10 mRNA 3"UTR 荧光素酶报告基因活性（P＜0.05），但对突变型IL-10 mRNA 3"UTR报告基因活性无显著影响（P＞0.05）。

表5 miR-513c-5p对IL-10 mRNA 3"UTR荧光素酶报告基因活性调控（±s）

表5 miR-513c-5p对IL-10 mRNA 3"UTR荧光素酶报告基因活性调控（±s）

注：与NC比较，*P＜0.05。

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2.4 miR-513c-5p 对IL-10 mRNA 及蛋白表达的影响 由表6 可见，细胞中IL-10 mRNA 表达及细胞上清中IL-10 蛋白水平抑表达组＞对照组＞过表达组（P均＜0.05）。

表6 miR-513c-5p对IL-10 mRNA及蛋白表达的影响（±s）

表6 miR-513c-5p对IL-10 mRNA及蛋白表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05。

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3 讨论

自2015 年我国全面实施二胎生育政策以来，高龄孕产妇的数量逐渐增多，URSA 发病率呈现增长趋势，URSA 不仅严重影响育龄妇女生殖健康，也给患者及其家庭乃至社会带来巨大压力。因此，阐释URSA 的发病机制、探索其诊治方法具有重要的临床价值和研究意义。研究发现，约80%的URSA 发病机制与免疫功能异常有关。随着生殖免疫研究的不断深入，维持母胎免疫耐受形成和导致RSA 发生的免疫失衡机制研究已经从系统免疫逐渐深入到母胎界面的细胞和分子微观水平［7］。

IL 是一组由多种细胞产生的可介导白细胞或免疫细胞间相互作用，发挥免疫调节功能的细胞因子。其中，IL-10 是一种重要的调节性细胞因子，主要由多种免疫细胞如T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等分泌［8］。IL-10 在炎症抑制和免疫调控过程中发挥了关键作用，其表达与功能异常参与了炎症、肿瘤等多种疾病的发生与发展［9-10］。母胎界面免疫研究发现，IL-10 在生殖免疫调控中发挥重要作用［11］。研究显示，URSA 患者外周血及局部母胎界面IL-10 表达均低于正常妊娠妇女，提示IL-10 参与了URSA 的发生与发展，但致使URSA中IL-10 表达降低的上游调控靶点还不十分清楚。因此，探索URSA 中IL-10 表达异常的调控机制将进一步从生殖免疫调控角度阐释URSA 的发病机制，为临床治疗提供新的依据。

随着生命科学研究的不断发展，人们发现曾因不能编码蛋白质而被称为基因组中不被关注的RNA 或“垃圾RNA”的非编码RNA 在许多生命活动过程中发挥了很重要的作用，成为生物医学研究的热点。miRNA 是重要的非编码RNA 之一，是一组长度为21～25 个核苷酸生物体基因组编码的内源性非编码小分子RNA。miRNA 具有高度保守性，是一类重要的基因表达调控因子，其作用于mRNA 主要的三个途径是靶基因裂解、翻译抑制或翻译增强。研究发现，miRNA 在细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥重要作用，其表达异常参与了多种疾病如肿瘤的发生发展及血管损伤等病理过程［12］。研究显示，miRNA 调控其靶基因表达与功能异常参与了自然流产的发生。例如，研究发现RSA 患者miR-365 表达升高，升高的miR-365 通过诱导滋养细胞凋亡参与流产发生［13］。此外，研究报道RSA 患者miR-27a-3p 表达升高通过靶向泛素特异性蛋白酶25（USP25）抑制滋养细胞迁移和侵袭导致流产发生［14］。我们的前期研究发现，miR-6165 能够靶向信号转导和转录活化因子3（STAT3）抑制pDC亚群分化打破母胎免疫耐受导致流产［15］，并发现miR-103 能够通过抑制信号转导和转录活化因子1（STAT1）逆转巨噬细胞极化异常减轻流产发生［16］。但是，miRNA 调控IL-10 表达在URSA 中作用与机制的研究尚未见报道［17］。

miR-513c-5p 是由位于人的X 染色体的编码基因编码的长度为22 个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，参与了多种癌症的发生发展多有报道，但其在妊娠及妊娠相关疾病的中作用仍不清楚［18-19］。本研究发现，URSA 组患者外周血PBMC 中miR-513c-5p较正常妊娠组表达明显升高，提示升高的miR-513c-5p 可能参与了URSA 发生。通过生物信息软件Target Scan 预测，我们发现miR-513c-5p与IL-10 mRNA 的3"UTR 之间存在潜在碱基互补结合位点，进一步提示miR-513c-5p 可能通过结合IL-10 mRNA 3"UTR 从而抑制其转录和蛋白表达。为证实这一设想，我们进行了双荧光素酶报告基因实验，结果证实miR-513c-5p与IL-10 mRNA 3"UTR可以碱基互补而直接结合。在这一发现的基础上，我们选用293T 细胞作为工具细胞，转染miR-513c-5p mimics上调miR-513c-5p 表达后，发现IL-10 mRNA 及蛋白表达水平均显著降低；而且，在转染miR-513c-5p inhibitor 抑制miR-513c-5p 表达后，IL-10 mRNA 及蛋白表达均显著升高。以上结果提示，miR-513c-5p能够通过与IL-10 mRNA 3"UTR 直接结合进而抑制IL-10 mRNA转录及蛋白表达。

综上所述，本研究结果证实miR-513c-5p 升高参与了URSA 的发生，阐释了miR-513c-5p 异常升高通过抑制其靶基因IL-10 的转录与翻译进而打破母胎免疫耐受状态导致URSA。本研究从非编码RNA表观遗传调控母胎免疫耐受角度进一步阐释了URSA 的发病机制，提示miR-513c-5p 有望成为URSA 诊断与预后评估的新的生物学指标，靶向调控miR-513c-5p/ IL-10 信号通路可能为临床治疗URSA的有效方法。