负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长及凋亡蛋白表达的影响

夏凡林，沈磊莹，曹阳，林子晶

1 上海城建职业学院健康与社会关怀学院，上海201415；2 上海交大医学院附属第九人民医院；3 重庆医科大学附属第二医院

近年来，我国乳腺癌的发病率迅速增长，在上海、北京等一线城市已居于女性恶性肿瘤之首位［1］，严重威胁女性健康。紫杉醇是广谱抗肿瘤药物，通过抑制细胞有丝分裂达到抑制肿瘤细胞生长的目的，已广泛用于卵巢癌、乳腺癌的临床治疗。但紫杉醇在血液中的溶解率低，不能达到最佳抑癌作用；目前常用的紫杉醇助溶剂聚氧乙烯蓖麻油易诱发严重的过敏、骨髓抑制、肾毒性等不良反应，限制了紫杉醇的临床应用［2］。以纳米材料为主的新型药物载体可提高紫杉醇的血液溶解度和药物稳定性，增强治疗靶向性和生物利用度，是紫杉醇抗癌治疗的新方向［3］。丝素蛋白具有独特的空间结构，其含有的羟基与氨基能够交联形成骨架结构，可很好地包载药物，增加组织对药物利用度。2019 年1 月—2020 年3 月，我们以丝素蛋白纳米粒子制备紫杉醇载体，观察其对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长及凋亡蛋白表达的影响，为乳腺癌的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 雌性昆明种小鼠100 只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于重庆医科大学第二附属医院动物医学中心清洁级动物饲养房进行饲养，温度20～25 ℃，湿度45%～55%。适应性喂养1周后用于实验。

1.1.2 细胞 小鼠乳腺癌EMT6 细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所，在重庆医科大学第二附属医院中心实验室培养。采用10%胎牛血清RMPI 1640 培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养，每3 d 换液1 次，并采用0.25%胰酶消化传代，待细胞呈对数生长期后进行后续实验。

1.1.3 试剂与仪器 兔抗鼠Bcl-2、Bax 单克隆抗体、荧光标记山羊抗兔IgG 及β-actin 多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；TRIzol 试剂购自美国Gibco 公司；蚕茧壳购自亳州市飒枫药业销售有限公司；Annexin V FITC/PI 细胞凋亡试剂盒购自碧云天生物技术公司。高效液相色谱仪（HITACHI，日本），流式细胞仪（贝克曼，美国）。

1.2 空白微球与载药微球的制备 取蚕茧壳10 g，加入0.02 mmol/L 碳酸钠300 mL，煮沸30 min，蒸馏水洗3 遍。重复操作3 遍，将洗净的蚕丝纤维烘干后，加入CaCl2混合溶剂，搅拌2 h。于透析袋中以纯净水透析48 h，得到丝素蛋白，4 ℃保存备用。空白微球的制备：将2%丝素蛋白溶液加入0.01 g/mL Span-80 的液体石蜡中进行乳化，25 min 后缓慢加入戊二醛固化，2 h 后洗涤，冷冻干燥后获得空白微球，即丝素蛋白纳米粒子。载药微球的制备：取紫杉醇（重庆美联药业有限公司，纯度＞99%）2 mg 加入乙醇溶液，超声5 min，待紫杉醇完全溶解后，按照空白微球的制备方法，将2%的丝素蛋白溶液和紫杉醇溶液逐步加入液体石蜡中，25 min 后缓慢加入戊二醛固化，2 h 后洗涤，冷冻干燥后获得载药微球［4］。

1.3 乳腺癌荷瘤小鼠模型的制备 取对数生长期EMT6 细胞，加入PBS 溶液稀释，用0.25%胰酶消化后，制成5×106/mL 的细胞悬液。向小鼠右前肢腋皮下注射0.2 mL 乳腺癌细胞悬液，建立乳腺癌荷瘤小鼠模型。

1.4 动物分组与干预 取造模成功的80 只小鼠，随机分为对照组、紫杉醇组、紫杉醇载体组、空白微球组各20只。紫杉醇组于接种后第8、11、14天给予紫杉醇5 mg/kg腹腔注射，紫杉醇载体组于相同时间点给予紫杉醇计算浓度为5 mg/kg 载药微球溶液腹腔注射，空白微球组注射等体积空白微球溶液，对照组注射等体积生理盐水。

1.5 观察指标

1.5.1 肿瘤生长抑制情况 造模后每5 d行B超检查1次，测定瘤体长径（a）、短径（b），以体积（V）=ab2/2 计算瘤体体积，制作生长曲线。抑瘤率=［1-（治疗组平均瘤体体积/对照组平均瘤体体积）］×100%。

1.5.2 肝肾功能 造模第22 天眶后静脉取血，采用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平。

1.5.3 肿瘤组织中紫杉醇药物浓度 采用高效液相色谱（HPLC）法检测。造模第22 天，取紫杉醇载体组、紫杉醇组小鼠，颈椎脱臼法处死，取肿瘤组织100 mg，以1∶5 的比例加入生理盐水制备成组织匀浆，9 000 g 离心10 min，取上清液0.5 mL，依次加入内标EPI、硫酸胺、饱和碳酸氢钠、氯仿/甲醇，混匀后600 g 离心10 min 后，转移下层有机相至另一试管中，再加入氯仿/甲醇，同法萃取3 次后，直至下层有机相合并，氮气吹干，取残留物加入流动相溶解，13 000 g离心10 min 后，取上清液15 μL 进行检测紫杉醇的药物浓度。

1.5.4 肿瘤细胞凋亡情况 采用流式细胞术检测。应用网措法将100 mg 肿瘤组织制成单细胞悬液，调整密度为1×107/mL。取单细胞悬液0.1 mL，依次加入5 μL的AnnexinV-FIT及5 μL PI，混匀后室温避光反应10 min。上流式细胞仪，采用Annexin V FITC/PI复染法检测细胞凋亡比例。

1.5.5 肿瘤组织凋亡相关蛋白表达 采用Western blotting 法检测。取肿瘤组织，液氮研磨后，TRIzol 法提取总蛋白。经过上样、SDS 电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭。加入1∶500 的兔抗鼠cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。洗膜，加入1∶1 000 的带有荧光标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2 h。洗膜，ECL 发光法显色，以β-actin 作为内参，采用GIS1000 分析软件检测蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以-x ± s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肿瘤生长抑制情况比较 接种8 d 后对照组、空白微球组、紫杉醇组、紫杉醇载体组瘤体体积分 别 为（219.35 ± 94.51）、（220.43 ± 69.81）、（217.57±95.72）、（218.57±85.26）mm3，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。药物干预后，对照组、空白微球组、紫杉醇组、紫杉醇载体组瘤重分别为（2.76 ± 0.55）、（2.69 ± 0.67）、（1.59 ± 0.27）、（1.19±0.21）g，紫杉醇载体组、紫杉醇组瘤重低于对照组和空白微球组，紫杉醇载体组瘤重低于紫杉醇组（P 均＜0.05）。空白微球组、紫杉醇组、紫杉醇载体组的抑瘤率分别为0.15%、51.24%、64.21%，紫杉醇载体组的抑瘤率高于紫杉醇组和空白微球组，紫杉醇组高于空白微球组（P均＜0.05）。

2.2 各组血清肝、肾功能指标比较 与对照组比较，其他三组血清肝、肾功能指标均无明显变化（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组血清肝、肾功能指标比较（±s）

表1 各组血清肝、肾功能指标比较（±s）

注：与对照组比较，P均＞0.05。

?

2.3 紫杉醇载体组与紫杉醇组肿瘤组织中紫杉醇浓度比较 紫杉醇载体组、紫杉醇组肿瘤组织中的紫杉醇浓度分别为（1.86±0.21）、（1.47±0.17）μg/mL，紫杉醇载体组高于紫杉醇组（P＜0.05）。

2.4 各组肿瘤细胞凋亡率比较 对照组、空白微球组、紫杉醇组、紫杉醇载体组肿瘤细胞凋亡率分别为18.2%、19.5%、34.3%、45.1%。紫杉醇载体组、紫杉醇组细胞凋亡率均高于对照组和空白微球组，且紫杉醇载体组高于紫杉醇组（P均＜0.05）。

2.5 各组肿瘤组织凋亡相关蛋白表达比较 与对照组和空白微球组相比，紫杉醇载体组、紫杉醇组cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达升高，Bcl-2 表达降低（P 均＜0.05）；且紫杉醇载体组cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达高于紫杉醇组，Bcl-2 表达低于紫杉醇组（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组肿瘤组织凋亡相关蛋白表达比较（±s）

表2 各组肿瘤组织凋亡相关蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与空白微球组比较，&P＜0.05；与紫杉醇组比较，#P＜0.05。

?

3 讨论

紫杉醇是一种二萜类化合物，其具有较好肿瘤细胞抑制作用，但由于水溶性差、生物利用度低而难以发挥最佳临床抗癌效果［2，5］。紫杉醇与聚氧乙烯蓖麻油等比例制成紫杉醇制剂可在一定程度上增加紫杉醇水溶性，但是聚氧乙烯蓖麻油容易引起过敏反应、骨髓抑制作用、肾毒性、心脏毒性等，并且制剂稀释后容易沉淀，可导致局部正常组织损伤，临床应用受到限制。近年来，紫杉醇脂质体、白蛋白紫杉醇等多种新剂型均被广泛应用于肿瘤临床治疗，具有化学性质稳定、存储时间长、不良反应少等优点［6］。SHANG 等［7］通过体外研究证实，将紫杉醇负载于羧甲基壳聚糖纳米载体可在短时间内增加局部肿瘤组织药物浓度，提升抑瘤效果。本研究成功构建负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子，分析其对乳腺癌小鼠模型抑癌效果，目前这方面还鲜见报道。通过HPLC 法检测药物浓度，发现紫杉醇载体组小鼠肿瘤组织中紫杉醇浓度明显高于以紫杉醇常规治疗的小鼠，提示负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子可通过提高紫杉醇的血液溶解度，提高肿瘤组织局部的药物浓度。

丝素蛋白是目前应用前景非常好的一种药物缓释载体［8-9］。作为天然高分子纤维蛋白，丝素蛋白主要由18 种氨基酸组成，与人体的部分组织结构相似，具有良好的组织亲和性，且安全无毒。同时，丝素蛋白带有氨基和羧基，两性解离性质的特征创造了独特的空间结构，不但能够很好地包载药物，并且具有较好可塑性，能够设计溶液、凝胶、粉末等多种形态［9-10］。因此，其与药物制成丝素蛋白纳米载体，可迅速穿透组织间隙，进入机体的细胞内发挥作用，提高药物的利用率，提升抑瘤效果。本研究结果显示，紫杉醇载体组抑瘤率明显高于紫杉醇组，提示负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子对乳腺癌瘤体生长有更佳的抑制作用，与紫杉醇在肿瘤组织浓度升高的研究结果基本一致。此外，我们推测紫杉醇载体组有更佳的抑瘤效果，可能也与丝素蛋白的缓释功能有关。丝素蛋白进入人体后，由于pH、温度等环境改变，丝素蛋白所带电荷、自身结构及相互作用可发生动态变化，影响药物复合体中药物的释放能力［11］；同时，在载体制作过程中，乙醇可增加丝素蛋白膜β-折叠，提其高结晶度及膜表面疏水性，减少药物“暴释”现象［12］。负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子可能通过缓释功能延长药物释放，增加组织对药物的生物利用时间，从而提高抑瘤效果。

促进细胞凋亡、抑制细胞增殖是抗肿瘤的重要机制［13］。紫杉醇主要作用靶点在细胞微管蛋白/微管系统，通过促进微管聚合、抑制微管降解将细胞阻滞在G2/M 期，最终导致细胞凋亡［14-15］。本研究分析乳腺癌小鼠模型肿瘤细胞凋亡情况，结果显示紫杉醇载体组小鼠肿瘤细胞凋亡率明显高于紫杉醇组小鼠，表明负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子可明显增加肿瘤细胞凋亡。进一步检测凋亡相关蛋白发现，紫杉醇载体组凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3 及Bax 明显高于紫杉醇组，抗凋亡蛋白Bcl-2 明显低于紫杉醇组，与细胞凋亡研究结果一致。Bax 是重要的细胞凋亡调控蛋白，其通过改变线粒体膜通透性、促进细胞色素C释放，经Caspase通路激活Caspase-3等途径引起细胞凋亡［16］。此外，Bax 表达增加还可以促进Bax-Bax 二聚体形成，抑制Bcl-2 的抗细胞凋亡作用［17］。TAN 等［17］通过动物模型研究证实，纳米粒子载体能够增加化疗药物治疗靶向性，认为其可能原因在于：纳米粒子载体通过激活肿瘤组织局部相关巨噬细胞吸收作用，从单细胞药物荷载到逐步释放药物至邻近肿瘤细胞进而发挥杀伤效应。我们推测，负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子能够促进肿瘤细胞凋亡，可能与其提高紫杉醇的治疗靶向性有关。

本研究观察了各组小鼠的一般情况，结果显示给药后各组小鼠肝肾功能无明显差异，提示基于丝素蛋白的纳米粒子紫杉醇载体对机体一般情况影响较小，无明显肝肾毒性，安全性较高。

综上所述，负载紫杉醇的丝素蛋白纳米粒子能够提高乳腺癌肿瘤组织局部的药物浓度，促进肿瘤细胞凋亡，较单纯使用紫杉醇抑癌效果更佳，且具有较高的安全性。但本研究仅进行体外动物实验，缺少细胞实验的机制研究作为支撑，部分推论可能存在局限性。本课题组后期会进一步完善相关实验理论研究，加强和其他研究机构合作进行临床研究，为乳腺癌的临床治疗提供新方向。