KLF5 介导p27kip1表达对胶质瘤U87 细胞增殖和侵袭的影响

方松，唐国强，陈加贝，李斌

郴州市第一人民医院，湖南郴州423000

胶质瘤是由脑神经胶质细胞引起的恶性肿瘤，是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。由于胶质瘤的多灶性发展和复发特点，患者预后较差，平均生存时间仅11～15 个月［1］。因此，阐明胶质瘤增殖和侵袭的内在机制对寻找新的治疗靶标具有重要意义。Kruppel 样因子5（KLF5）是KLF 家族的关键成员，在不同类型肿瘤中发挥的作用不同。研究显示，KLF5在前列腺癌和宫颈癌组织中表达缺失或下调，发挥抑癌基因的作用［2-3］，在非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤中具有促进细胞增殖、侵袭和迁移的作用［4-6］。YANG 等［7］报 道，MCM3AP-AS1/miR-211/KLF5/AGGF1 轴对胶质瘤血管生成具有调控作用，可作为胶质瘤抗血管生成治疗的新靶标，提示KLF5可能与胶质瘤的增殖和侵袭有关。研究显示，p27kip1是肿瘤恶性进展的抑制因子［8-9］，在乳腺癌中KLF5可抑制p27kip1的表达而发挥促癌作用［10］。2019 年7 月—2020 年6 月，我们采用小干扰RNA（siRNA）抑制胶质瘤细胞U87中KLF5表达，观察其对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响，并探讨p27kip1在此过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞系U87 购于中国科学院上海细胞库；DMEM 培养基和胎牛血清购于美国Hyclone 公司；KLF5 siRNA 和p27kip1siRNA 购于广州锐博生物技术有限公司；Lipofectamine2000 转染试剂、蛋白裂解液和Giemsa 染液购于北京索莱宝试剂公司；BCA 蛋白浓度检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于上海碧云天生物试剂有限公司；细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6），上皮间质转化蛋白Snail1，以及KLF5、GAPDH 抗体购自英国Abcam 试剂公司；ECL 化学发光试剂盒购于美国Thermo 公司；MTS 试剂购自中国北京百奥莱博科技有限公司；Transwell 小室购自美国Coring试剂公司。

1.2 细胞培养 取U87细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。观察细胞生长状态，及时更换细胞培养基。显微镜下观察细胞长满时，采用胰酶按照1∶3的比例进行细胞传代。

1.3 KLF5对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响及机制观察

1.3.1 细胞分组与转染 收集细胞，加入胰酶消化，制备单细胞悬液。以1.0×105/孔铺至6 孔板中，将细胞分为si-NC 组、si-KLF5 组，放置培养箱中培养。待细胞贴壁后，si-NC 组加入10 pmol NC siRNA和含5 μg Lipofectamine2000 的无血清培养基混合液，si-KLF5 组加入10 pmol KLF5 siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 转染试剂的无血清培养基混合液，置于培养箱中继续培养。6 h后更换新鲜完全培养基，转染48 h用于后续实验。

1.3.2 细胞增殖能力观察 采用MTS 法。收集两组细胞，加入胰酶消化，离心收集细胞，加入培养基制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×106/L。以2×103/孔接种至96 孔板，每组设5 个复孔，置于培养箱中培养。以细胞贴壁时计为0 h，于0、24、48、72 h取细胞加入MTS试剂孵育2 h，按照说明书采用全波长扫描仪检测490 nm处各孔光密度（OD）值。

1.3.3 细胞周期检测 收集两组细胞（每组设置3个复孔），加入胰酶消化。每管1.0×106个细胞，PBS洗3 次，加入1 mL 80%乙醇4 ℃固定细胞2 h。PBS洗1 次后，加入500 μL 的细胞周期染色缓冲液、25 μL碘化丙啶（PI）染液和10 μL RNA酶，混匀后37 ℃避光孵育30 min。采用流式细胞仪检测细胞在不同细胞周期的比例。

1.3.4 细胞侵袭能力观察 采用Boyden 实验。将基质胶稀释后加入Transwell 小室中，制备Boyden 小室。收集两组细胞，加入胰酶消化，无血清培养基重悬细胞后计数，调整细胞密度为1×106/mL。每组设3 个复孔，采用无血清培养基洗3 次，取100 μL 细胞加至Boyden 小室的上室中，500 μL 完全培养基加至Boyden 小室的下室中，放置细胞培养箱中培养。显微镜下观察，Boyden 小室下室中有穿膜掉落的细胞时终止培养，用PBS 将Boyden 小室上室面未穿过的细胞洗去，甲醇固定小室15 min，并采用Giemsa 染色，干燥后显微镜下计数穿膜细胞数目。

1.3.5 细胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1 蛋白检测 采用Western blotting 法。收集两组细胞，加入蛋白裂解液，4 ℃、14 000 r/min 离心30 min。取蛋白上清液，BCA法检测蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性。取蛋白样品，加入凝胶，100 V电泳2 h分离目的蛋白，350 mA转膜2 h将蛋白转移到PVDF膜上，加入5%脱脂牛奶常温孵育1 h 封闭非特异性蛋白。依次加入目的蛋白的一抗（稀释浓度均为1∶500）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h。TBST 冲洗3 次，采用ECL 化学发光试剂盒显示蛋白条带，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。以目标蛋白与内参GAPDH 条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.4 干扰p27kip1表达对KLF5 作用下胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响观察 采用Western blotting 法检测si-NC 组和si-KLF5 组p27kip1蛋白表达，结果显示两组p27kip1蛋白相对表达量分别为0.21 ± 0.03、0.59 ± 0.08，si-KLF5 组p27kip1蛋白表达高于si-NC组（P＜0.01）。取培养后的U87 细胞，分为si-NC 组、si-KLF5 组 和si-KLF5+si-p27kip1组，si-NC 组 加 入10 pmol NC siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 的无血清培养基混合液，si-KLF5 组加入10 pmol KLF5 siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 的无血清培养基混合液，si-KLF5+si-p27kip1组加入10 pmol KLF5 siRNA+10 pmol p27kip1siRNA 和 含 5 μg Lipofectamine2000 的无血清培养基混合液，按照“1.3.2”和“1.3.4”的方法检测细胞增殖能力和侵袭能力。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以±s 表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KLF5对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

2.1.1 两组细胞增殖能力比较 细胞培养48、72 h时，si-KLF5 组OD 值较si-NC 组降低（P 均＜0.01）。见表1。

表1 两组不同时间点OD值比较（±s）

表1 两组不同时间点OD值比较（±s）

注：与si-NC组比较，*P＜0.01。

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2.1.2 两组细胞周期比较 si-KLF5 组G1期细胞比例较si-NC组增加（P＜0.05）。见表2。

表2 两组细胞周期比较（%，±s）

表2 两组细胞周期比较（%，±s）

注：与si-NC组比较，*P＜0.05。

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2.1.3 两组细胞侵袭能力比较 si-KLF5 组和si-NC 组的穿膜细胞数分别为（39.67 ± 6.94）、（85.33± 10.54）个，si-KLF5 组穿膜细胞数较si-NC 组减少（P＜0.01）。

2.1.4 两组细胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1 蛋白表达比较 与si-NC 组相比，Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表达水平均降低（P 均＜0.01）。见表3。

表3 两组细胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表达比较（±s）

表3 两组细胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表达比较（±s）

注：与si-NC组比较，*P＜0.01。

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2.2 干扰p27kip1表达对KLF5 作用下的胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

2.2.1 三组细胞增殖能力比较 si-KLF5+si-p27kip1组细胞增殖能力较si-NC 组降低，较si-KLF5 组增加（P均＜0.05）。见表4。

表4 三组不同时间点OD值比较（±s）

表4 三组不同时间点OD值比较（±s）

注：与si-NC组比较，*P＜0.05；与si-KLF5组比较，#P＜0.05。

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2.2.2 三组细胞侵袭能力比较 si-NC 组、si-KLF5组、si-KLF5+si-p27kip1组的穿膜细胞数分别为（91.67± 13.20）、（40.67 ± 8.11）、（69.33 ± 6.08）个。si-KLF5+si-p27kip1组穿膜细胞数较si-NC 组减少（P＜0.01），较si-KLF5组增加（P＜0.05）。

3 讨论

胶质瘤也称为神经外胚层或神经上皮肿瘤，发生在神经外胚层中，通常表现出包括广泛、快速和侵略性进展等一系列恶性特征，导致患者对手术、放疗和化疗的抵抗，致使大多数患者预后不良，并影响患者的身心健康。因此，探索胶质瘤进展的分子机制，对开发可改善患者预后的新疗法至关重要。

KLF5 基因位于13q21 号染色体上，其蛋白包含富含脯氨酸的反式激活结构域和3 个锌指结构域。大量研究表明，KLF5与人类恶性肿瘤之间存在密切关联，可调节细胞增殖、血管生成、多能性、炎症和迁移等许多关键细胞过程［11-12］。KLF5 通过调节DNA损伤检查点蛋白抑制DNA 损伤反应，促进非小细胞肺癌患者对顺铂的耐药性，抑制KLF5 可能是治疗肿瘤的潜在靶点［4］。在甲状腺癌中，干扰KLF5 表达可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力［13］。在胶质瘤中，KLF5 通过参与MCM3AP-AS1/miR-211/KLF5/AGGF1 轴促进胶质瘤的血管生成，敲低MCM3AP-AS1 可通过上调miR-211 表达降低KLF5、AGGF1表达，从而抑制血管生成［7］。这表明KLF5能够促进胶质瘤的发生发展。本研究结果显示，干扰KLF5 表达后，U87 细胞的增殖和侵袭能力降低，与KLF5 在前列腺癌和肝细胞肝癌中的研究［14-15］结果一致。

细胞增殖与细胞周期密切相关。Li 等［6］报道，KLF5 能够促进胰腺癌细胞中细胞周期的G1/S 期进程，从而抑制胰腺癌细胞的增殖。本研究结果显示，干扰KLF5 表达后，U87 细胞周期阻滞在G1期，这表明KLF5 促进胶质瘤细胞增殖的作用机制与调控细胞周期相关。

KLF5 作为一种重要的转录因子发挥多种作用机制。KLF5可通过促进核因子κB 从细胞质至细胞核的易位过程，促进甲状腺癌细胞的增殖和侵袭能力［13］。KLF5 可通过调控Snail1 基因的表达，抑制宫颈癌细胞的上皮间质转化过程，降低宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力［3］。在乳腺癌中KLF5 调控的长链非编码RNA RP1 通过抑制p27kip1发挥致癌作用［10］。p27kip1属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，被视为肿瘤抑制因子。p27kip1通过稳定Cyclin D1-CDK4/6复合物中止细胞周期G1～S 期相变进程［10］。同时研究显示，p27kip1与肿瘤细胞的侵袭和迁移相关，p27kip1阳性表达与食管癌患者的淋巴结转移呈负相关［16］，RP1 通过抑制p27kip1蛋白表达调控Snail1 蛋白来维持乳腺癌细胞的上皮间质转化［10］。本研究结果显示，干扰KLF5 表达后，U87 细胞p27kip1蛋白表达增加，细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6 表达降低，上皮间质转化蛋白Snail1 表达降低，表明干扰KLF5 表达可能通过促进p27kip1表达抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6 和Snail1 的表达，进而抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。进一步在KLF5 siRNA 干扰组中抑制p27kip1表达后发现，减少p27kip1表达可以增加KLF5 siRNA 组细胞的增殖和侵袭能力，进一步表明KLF5介导p27kip1的表达促进胶质瘤细胞的进展。

综上所述，干扰KLF5 的表达抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，可能介导p27kip1的表达调控细胞周期蛋白的上皮间质转化蛋白实现的，KLF5可能是抗胶质瘤治疗的潜在分子靶点。但是本文未对KLF5 与p27kip1之间的具体作用机制进行研究，存在不足，有待后续继续深入探讨。