BMP-4对甲状腺乳头状癌细胞生物学行为的影响及其分子机制

孟晓梅，巴茂文，王绍光，于岁，李宁，唐与晓

青岛大学附属烟台毓璜顶医院，山东烟台264000

甲状腺癌是最常见的内分泌器官来源的恶性肿瘤，近年来其发病率呈逐渐上升趋势。甲状腺乳头状癌（PTC）是甲状腺癌中最常见的类型，部分PTC具有较高的侵袭性，导致生存率及生存质量下降。研究显示，上皮—间质转化（EMT）在甲状腺癌细胞侵袭转移中起重要作用［1］。细胞通过EMT获得转移和侵袭能力，多个因子如Snail、Slug、Twist 等参与调节EMT［2］。骨形态发生蛋白4（BMP-4）是骨形态发生蛋白（BMPs）家族成员之一，其在多种类型的肿瘤中有表达，对肿瘤细胞生长的影响呈现多样性，可促进神经胶质瘤、前列腺癌及肝癌细胞增殖［3-5］，抑制乳腺癌和肺癌细胞生长［6-7］，对恶性黑色素瘤和卵巢癌细胞生长则没有影响［8-9］。研究发现，BMP-4 与肿瘤细胞发生EMT 有关，BMP-4能够通过诱导EMT 促进肝癌细胞侵袭和转移，沉默BMP-4 基因可阻止EMT 的发生及肿瘤转移［10］。BMP-4 可通过Smad 依赖性信号通路发挥促进肿瘤侵袭和转移的作用［11］，其中Smad1参与BMPs信号转导，在信号由细胞膜传递至细胞核的过程中起关键性作用。目前关于BMP-4 在PTC 中作用的研究尚未见报道。2018 年11月—2019年10月，我们通过观察BMP-4对PTC细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响，并探讨其与Smad1信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 PTC 细胞株TPC-1、K1、B-CPAP 购自中国科学院上海细胞库。凋亡试剂盒购自eBioscience 公司，侵袭试剂盒及RMPI1640 购自Corning 公司，ECL 检测试剂盒购自北京天根生化科技公司。胎牛血清购自Ausbian 公司，反转录试剂盒购自Promega 公司，聚丙烯酰胺购自Bio-Rad 公司。兔抗人GAPDH 多克隆抗体、兔抗人E-Cadherin多克隆抗体、兔抗人Vimentin 单克隆抗体及兔抗人Smad1 单克隆抗体均购自Chemicon Millipore 公司。过表达及干扰BMP-4 重组慢病毒、引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

1.2 BMP-4 mRNA 高表达和低表达PTC 细胞的筛选 取B-CPAP、TPC-1、K1 细胞，加入含10%FBS 的RMPI1640 培养液，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，每天在倒置显微镜下观察细胞的密度、形态以及贴壁情况，当细胞融合度达到80%～90%时用于实验。采用qPCR 法检测细胞中BMP-4 mRNA表达水平。TRIzol 法提取细胞总RNA，反转录获得cDNA，以此为模板进行qPCR 扩增。引物序列：BMP-4 上 游5"-CCTGGGCACCTCATCACA-3"，下 游5"-CATAGTTTGGCTGCTTCTC-3"。反应条件：95 ℃预热30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 个循环。以GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCt法计算BMP-4 mRNA 的相对表达量。结果显示，B-CPAP 细胞BMP-4 mRNA表达量最低，TPC-1细胞BMP-4 mRNA表达量最高。

1.3 细胞分组与病毒感染 取B-CPAP、TPC-1 细胞，加入胰酶消化，用完全培养基制成（3～5）×104/mL的细胞悬液，接种到培养板中。培养至铺板量达到15%～30%后，将B-CPAP 细胞分为阴性对照组和过表达组，分别感染阴性片段、过表达BMP-4 重组慢病毒；TPC-1 细胞分为阴性对照组和干扰组，分别感染无效干扰片段和干扰BMP-4 重组慢病毒。病毒滴度：B-CPAP阴性对照组为1×109TU/mL，过表达组为5×108TU/mL；TPC-1 阴性对照组为6×108TU/mL，干扰组为8×108TU/mL。加入病毒后10 h 换为常规培养基培养。感染后72 h，荧光显微镜观察感染率达到70%以上，表明感染有效，可进行下一步实验。

1.4 细胞增殖能力观察 采用MTT 法。感染5 d后收集各组细胞，加入胰酶消化。加入含10% FBS的DMEM 培养液并中和、离心收集，重悬后获得细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL，接种于96 孔板中培养5 d。从铺板后次日开始，培养终止前4 h 加入20 μL 5 mg/mL MTT，作用4 h 后吸去培养液，加100 μL DMSO 溶解甲瓒颗粒，振荡2～5 min。上酶标仪，于490 nm波长处检测光密度（OD）值。

1.5 细胞凋亡检测 采用Annexin V-APC 单染法。感染5 d 后收集各组细胞，胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，接种于6 孔板中，每组设3 个复孔（为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×105/L）。1 300 r/min 离心5 min，弃上清，4 ℃预冷的D-Hanks（pH=7.2～7.4）洗涤细胞沉淀，1×binding buffer 洗涤细胞沉淀，1 300 r/min 离心3 min，收集细胞，200 μL 1×binding buffer 重悬细胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC 染色，室温避光10～15 min，根据细胞量，补加400～800 μL 1×binding buffer，上机检测。使用流式细胞仪分析软件Guava InCyte进行分析。

1.6 细胞侵袭能力观察 采用Corning 实验。上室中培养基加入500 μL细胞悬液，下室内加入750 μL 30% FBS 培养基，同时使用该细胞悬液铺一块MTS 96 孔板，每孔接种5×103个细胞，接种后即测定OD570，作为侵袭参照。37 ℃培养箱培养B-CPAP 细胞18 h，培养TPC-1 细胞48 h，移去小室内非侵袭细胞，染色转移细胞3～5 min 后，将小室浸泡冲洗数次，晾干，显微镜拍照计数。

1.7 细 胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA 检测 感染后72 h 采用qPCR 法进行检测，实验步骤同“1.2.2”。引物序列：E-Cadherin 上游：5"-AACGCATTGCCACATACA-3"，下游：5"-CGGGCTTGTTGTCATTC-3"；Vimentin 上 游 ：5"-AATGGCTCGTCACCTTCG-3"，下游：5"-CTAGTTTCAACCGTCTTAATCAG-3"；Smad1 上 游：5"-ATGCCGAATGCCTTAGTG-3"，下 游：5"-ACATCCTGGCGGTGGTA-3"；GAPDH 上游：5"-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3"，下游：5"-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3"。

1.8 细胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1蛋白检测 采用Western blotting法。感染72 h 后收集细胞，提取蛋白，每孔道上40 μg 蛋白样品，聚丙稀酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗孵育（兔抗人E-Cadherin 多抗、兔抗人Vimentin 单抗，兔抗人Smad1 单 抗，兔抗人GAPDH 多 抗，均1∶1 000 稀释），4 ℃过夜共孵育，次日洗膜，二抗孵育（辣根过氧化物酶标记的相应二抗，1∶5 000 稀释），洗膜，显像。采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参灰度值比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s 表示，两组间比较采用配对t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 B-CPAP 细胞中，过表达组和阴性对照组OD 值分别为2.96 ± 0.05、2.55±0.01，过表达组高于阴性对照组；TPC-1 细胞中，干扰组和阴性对照组OD 值分别为2.26±0.10、4.04±0.06，干扰组低于阴性对照组（P均＜0.01）。

2.2 各组细胞凋亡率比较 B-CPAP细胞中，过表达组和阴性对照组的细胞凋亡率分别为1.63%±0.10%、3.60% ± 0.21%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；TPC-1细胞中，干扰组和阴性对照组的细胞凋亡率分别为16.29%±0.78%、4.52%±0.19%，干扰组高于阴性对照组（P＜0.01）。

2.3 各组细胞侵袭能力比较 B-CPAP 细胞中，过表达组和阴性对照组细胞转移数分别为（58 ± 5）、（53±3）个，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；TPC-1 细胞中，干扰组和阴性对照组的细胞转移数分别为（14 ± 1）、（21 ± 3）个，干扰组少于阴性对照组（P＜0.05）。

2.4 各组E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA 及蛋白表达比较 B-CPAP细胞中，过表达组和阴性对照组E-Cadherin、Vimenin、Smad1 mRNA 及蛋白表达比较差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表1；TPC-1细胞中，干扰组和阴性对照组E-Cadherin、Smad1 mRNA 及蛋白表达量比较差异无统计学意义（P 均＞0.05），Vimenin mRNA 及蛋白表达量干扰组低于阴性对照组（P＜0.01），见表2。

表1 两组B-CPAP细胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表达比较（±s）

表1 两组B-CPAP细胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表达比较（±s）

注：与阴性对照组比较，P均＞0.05。

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表2 两组TPC-1细胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表达比较（±s）

表2 两组TPC-1细胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表达比较（±s）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.01。

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3 讨论

大部分PTC患者经过有效合理的治疗后预后良好，但部分PTC 具有较高的侵袭性，出现肿瘤进展、转移和术后复发等，导致患者的生存率及生存质量下降。因此，研究PTC 细胞的生长、浸润和转移过程，寻找PTC 中差异性表达、预测肿瘤侵犯、转移的生物学标记和干预治疗的分子，对于进一步改善患者预后具有重要意义。BMP-4 是骨形态发生蛋白BMPs 家族成员之一，表达于多种类型的肿瘤，且对不同肿瘤细胞生长的影响不同。我们前期对PTC患者的研究显示，BMP-4蛋白在肿瘤直径＞1 cm患者中的高表达率高于肿瘤直径≤1 cm 者，在有包膜浸润患者中的高表达率高于无包膜浸润者，在TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期患者中的高表达率高于Ⅰ+Ⅱ期者。这提示高表达BMP-4的PTC患者更容易发生肿瘤侵袭转移，BMP-4 可能在PTC 的侵袭和转移中起重要作用［12］。

肿瘤共性的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和调亡过少。MA等［13］报道，BMP-4可通过加速G1/S细胞周期进展而促进肝癌细胞增殖。本研究结果显示，PTC细胞系B-CPAP、TPC-1、K1 中均可检测到BMP-4 表达，B-CPAP细胞感染过表达BMP-4慢病毒后增殖能力增加，TPC-1 细胞感染干扰BMP-4 慢病毒后增殖能力下降而凋亡率增加，表明BMP-4 可促进PTC 细胞增殖、抑制其凋亡。

上皮细胞丧失极性、黏附性下降，且细胞骨架重塑，转化为具有活动能力的间质细胞，这个过程被称为EMT。EMT 与肿瘤的侵袭、转移密切相关。KNAUF 等［14］报道，PTC 进展至低分化癌过程中癌细胞发生了EMT。VASCO 等［15］研究显示，与肿瘤中心区域比较，PTC 侵袭性区域中EMT 相关基因表达升高。BMP-4 对肿瘤细胞转移及EMT 有调节作用，且在不同肿瘤中的表现不同。DENG等［16］报道，BMP-4通过诱导EMT 促进胃癌转移；FEELEY 等［17］报道，BMP-4 对前列腺癌细胞系的细胞转移没有影响；ZHAO 等［18］报 道，BMP-4 可 促 进 胶 质 瘤 细 胞ECadherin 表达从而抑制肿瘤转移；在乳腺癌细胞系MDA-MB-231 和MCF-7 中，BMP-4 高表达可抑制肿瘤细胞增殖、促进侵袭和转移，具有抑制肿瘤及促进肿瘤的双重作用［6，19］。KETOLAINEN 等［20］对9 个乳腺癌细胞系给予外源性BMP-4 后，所有细胞系都表现出细胞增殖能力下降，而细胞转移的变化在不同的细胞系表现不同。MDA-361 细胞转移能力显著增加，T-47D细胞转移能力下降，而HCC38、SK-BR-3、ZR-75-30 细胞转移能力无明显变化。以上研究表明，肿瘤细胞对BMP-4 作用的反应各异，存在细胞特异性。本研究结果显示，B-CPAP细胞过表达组与阴性对照组的细胞侵袭能力无明显差异，TPC-1 细胞干扰组的侵袭能力较阴性对照组下降，表明BMP-4可增加TPC-1细胞的侵袭能力，对B-CPAP细胞侵袭能力则没有产生影响。两个细胞系表现不同，可能是细胞系特异性所致。

E-Cadherin 是上皮细胞标志物，抑制E-Cadherin表达或阻断其功能可致细胞间质形态改变，有利于细胞侵袭和转移［21］。Vimentin 是间质细胞标志物，除了参与构成细胞支架、维持细胞的完整性外，还与肿瘤的侵袭、转移关系密切［22］。RODRIGUEZ 等［23］报道，Vimentin 可能是EMT 的上游调节因子，沉默Vimentin 基因后，EMT 过程可出现逆转。本研究结果显示，虽然B-CPAP 细胞两组间E-Cadherin 及Vimentin mRNA 及蛋白表达无明显差异，但TPC-1细胞干扰组Vimentin 的表达低于阴性对照组，提示BMP-4在该细胞系与EMT的发生有关。

BMPs 发挥作用主要是通过Smad 依赖性及非Smad依赖性两条信号通路［24］。Smad蛋白是Smad依赖性通路中细胞内信号传导的枢纽［25］，其中Smad1参与BMPs 信号转导，在信号由细胞膜传递至细胞核的过程中起到了关键性的作用。此外，BMPs还可通过其他信号通路来发挥作用，包括细胞外调节蛋白激酶、p38 丝裂原活化蛋白激酶通路［18］。研究发现，BMP-4可通过Smad依赖性信号通路发挥促进肿瘤侵袭转移的作用，还可通过非Smad依赖性信号通路发挥作用［26］。本研究结果显示，B-CPAP细胞过表达BMP-4 及TPC-1 细胞干扰BMP-4 表达后，与阴性对照组相比Smad1 均无明显变化，提示在PTC 细胞系中BMP-4 发挥作用不是通过Smad1 通路，可能是通过其他通路。

综上所述，BMP-4 在PTC 细胞中存在表达且具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，干扰BMP-4 表达可抑制细胞发生EMT 及细胞转移，提示BMP-4 可能成为预测PTC 侵袭转移的生物学标记，但关于BMP-4 发挥作用经由的信号通路及调控机制还需要进一步的研究。