外源赤霉素与氯化钙对哈茨木霉生长的影响

俞春锦

（山东阳谷县农业农村局，山东 阳谷 252300）

长期大量使用化学农药对生态环境和人类健康已经产生了巨大危害。利用生物防治菌作为生物杀菌剂的生物防治方法可以有效地克服这些弊端，因而生物农药越来越受到人们的重视。其中拮抗微生物在植物病虫害生物防治中的应用备受人们关注[1-2]。在目前已发现的拮抗微生物中，木霉菌（Trichoderma spp.）具有很好的生防活性。

木霉菌（Trichoderma spp.）是防治植物病原真菌病害的重要生防因子。按传统分类系统，隶属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丝孢科[3]。木霉适应性广，几乎在所有种植农作物的土壤中都有木霉真菌存在，其广泛存在于根围、叶围、种子和球茎等生态环境中[4]。自从Weinding首先发表了木霉菌对多种植物病原菌具有拮抗作用以来[5]，目前已研究发现木霉至少对18 个属29 种植物病原真菌在体外或体内表现有拮抗作用，以哈茨木霉的使用最为广泛。近年来人们发现，除了在生物防治方面有很重要的作用之外，哈茨木霉还在促进植物生长、诱导植物产生抗病性、降低连作障碍等方面有一定的作用[6]。

但是哈茨木霉菌的产量低成为制约哈茨木霉菌发展应用的重要因素。常用的哈茨木霉（T. harzianum）的培养过程为：先通过马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）进行一级培养后，再将孢子洗脱后植入麦麸中进行二级培养，形成麦麸制剂。近年来，对于哈茨木霉菌的液体培养技术研究主要集中在二级培养阶段，但是一级培养技术培养周期长、成本高，在一定程度上制约了哈茨木霉的规模生产，同样需要进一步的改进和完善[7]。

赤霉素（GA3）最早是从赤霉菌培养基的滤液中分离出的活性物质，在植物体内具有提高生长素含量、促进细胞伸张、促进细胞分裂、促进细胞扩大的作用[8-11]。

钙离子是机体维持各项生理活动不可缺少的离子。在动物体内钙离子对于维持细胞膜两侧的生物电位、神经传导功能、肌肉伸缩与舒张功能以及神经-肌肉传导功能、激素的作用机制等方面具有重要作用[12]。在植物生长方面，钙离子作为植物细胞的第二信使，与植物的代谢调控、极性建立、细胞伸长、气孔关闭、生长发育等很多方面有关[13-14]。有研究表明，钙离子能够促进真菌对一些元素的吸收并能够促进真菌的生长，因此对于哈茨木霉菌的生长应有同样作用[15]。本试验通过在培养基中添加不同质量浓度的GA3和CaCl2，探讨了GA3和CaCl2对哈茨木霉生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基购自远慕生物公司、哈茨木霉菌由山东大学微生物重点试验室提供。

1.2 方法

分别在PDA 培养基中添加GA3和CaCl2的质量浓度为 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.2 mg/L，以不添加 GA3和 CaCl2的培养基为对照（CK）。在无菌操作台上，利用直径为0.392 cm 的打孔器进行接种哈茨木霉菌。在无菌人工气候培养箱中无光25℃下培养，每天进行菌落直径的测定。

2 结果与分析

2.1 GA3 对哈茨木霉菌生长的影响

试验结果表明，培养24 h 后，不同质量浓度GA3溶液处理的PDA 培养基造成哈茨木霉菌落直径大小顺序为：0.8 mg/L＞0.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.4 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L，GA3质量浓度为 0.1、0.2 和 0.8 mg/L 时均可明显促进哈茨木霉菌生长，其中0.8 mg/L 的GA3处理下哈茨木霉菌的直径是对照的1.42 倍，统计分析表明与对照相比差异极显著；质量浓度为0.4、1.2 mg/L 时同样促进哈茨木霉菌落的生长，但促进作用相对较低。因此，在前24 h，GA3溶液对促进哈茨木霉菌落的最适质量浓度为0.8 mg/L，质量浓度范围为 0.4～0.8 mg/L。

培养36 h 后，不同质量浓度GA3溶液处理的PDA培养基造成哈茨木霉菌落直径大小顺序为：0.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.8 mg/L＞0.4 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L，GA3质量浓度为0.1 mg/L 和0.2 mg/L 时均可明显促进哈茨木霉菌生长速度；0.2 mg/L 的GA3处理下哈茨木霉菌的直径是对照的1.35 倍，质量浓度为0.4、0.8 mg/L 时同样促进哈茨木霉菌落的生长，但促进作用相对较低；各处理与对照差异极显著（图1）。

图1 GA3 对哈茨木霉菌落直径的影响

2.2 CaCl2 对哈茨木霉菌生长的影响

CaCl2对哈茨木霉菌生长的影响如图2 所示，试验结果表明，培养24 h 后，不同质量浓度钙离子溶液处理的哈茨木霉菌落直径大小顺序为：0.2 mg/L＞0.4 mg/L＞0.8 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L＞0.1 mg/L，钙离子质量浓度为0.2 mg/L 时促进哈茨木霉菌生长速度不明显，在添加0.2 mg/LCaCl2的平板中菌落直径仅是对照的1.04 倍。

图2 CaCl2 对哈茨木霉菌落直径的影响

培养36 h 后，添加了不同质量浓度CaCl2的PDA 培养基中哈茨木霉菌落直径大小顺序为：0.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.8 mg/L＞0 mg/L＞1.2 mg/L＞0.4 mg/L，钙离子质量浓度为0.2 mg/L 时可促进哈茨木霉菌生长，此时培养基中菌落直径仅为对照的1.08 倍。钙离子质量浓度为1.2 mg/L和0.4 mg/L 时可抑制哈茨木霉菌生长，此时培养基中菌落直径比对照分别减小了0.03 和0.29倍。

3 结论与讨论

近年来，国内外学者对哈茨木霉菌培养条件的优化进行了很多研究。王慧中等[16]通过浅层液体培养技术对哈茨木霉菌的最适pH 做了研究，指出了最适pH 在4～6之间；王慧中等[17]利用虫草头孢发酵废液为母液制成的组合培养液培养哈茨木霉，其培养效果明显优于其他培养液，为工业化生产哈茨木霉提供了新思路。蔡爱群等[18]对钙、铁和锰对2 种灵芝液体培养菌丝体生物量影响的研究表明钙离子对松杉灵芝在Ca 质量浓度为200 mg/L时生物量最高，指出钙离子对真菌生长有一定的影响。

但是固体培养技术，尤其是关于植物激素和钙离子对哈茨木霉生长的研究多没有涉及。本试验是通过不同质量浓度的GA3和钙离子分别对哈茨木霉菌的固体培养做出研究，通过观察菌落的直径来探讨其对哈茨木霉菌生长的影响，从而揭示植物激素和钙离子对哈茨木霉菌是否具有相互作用。为进一步研究促进哈茨木霉菌产量的培养基提供重要参考。