PI3K/AKT信号通路对骨骼肌再生的影响研究进展

2021-01-29吕欣周达岸

中国运动医学杂志 2020年11期

吕欣周达岸

锦州医科大学附属第三医院（辽宁锦州121000）

骨骼肌损伤是一种高频度损伤，损伤后肌肉的收缩性能会随之降低，并且周围肌肉发生再损伤的概率也会增加。骨骼肌发生损伤时，首先是炎症期，会发生中性粒细胞等浸润、血管束架构混乱、肌纤维排列紊乱；进展到修复期时，出现新生肌纤维和血管，早期瘢痕形成；到重塑期时，新生肌纤维粘附在细胞外基质，出现大量瘢痕[1，2]。骨骼肌损伤修复的病理进程离不开相应的基因、蛋白、生长因子及细胞因子等的调控，它们的启动和传导又需要信号通路的激活，其中磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase，PKB ，即AKT）信号通路作为受体信号向细胞内传导的重要途径之一，具有调节细胞增殖、分化及蛋白合成等的功能。目前已有研究发现[3-5]，PI3K/AKT信号通路与骨骼肌的修复再生密切相关，不仅能够促进骨骼肌蛋白质合成，而且还能够激活肌卫星细胞（muscle satellite cells，MSCs）的增殖，而增殖的肌卫星细胞能够再生新的肌细胞，进而促进骨骼肌再生、修复损伤。本文基于PI3K/AKT信号通路对骨骼肌再生的影响作一综述，旨在深入了解PI3K/AKT 信号通路对骨骼肌再生的作用机制，为临床治疗提供基础依据和思路。

1 PI3K/AKT 信号通路组成

PI3K 是组成磷脂酰肌醇激酶的重要组分，主要存在于细胞质中，并且具有磷脂酰肌醇激酶和丝/苏氨酸激酶的活性，由于其底物特异性、结构与功能不同，PI3K 被分为了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。其中Ⅰ型在肿瘤疾病中被广泛研究，根据其调节亚单位和上游调节分子不同又分为ⅠA、ⅠB两型，ⅠA型是由调节亚基p85和催化亚基p110 组成的异源二聚体，调节亚基p85 含有SH2和SH3 结构域[6]，催化亚基p110 具有P110α、P110β和P110δ 3种亚型，分别由PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD基因编码，广泛存在于各种细胞中，可被细胞表面酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）和Ras 激活[7]；ⅠB型PI3K 由催化亚基p110γ和调节亚基p101 或p84 组成的异源二聚体，p110γ由PIK3CG编码，并且仅限于白细胞内存在，主要是被G-蛋白耦联受体（G-proteincoupled receptor，GPCR）激活[8]。Ⅱ型PI3K 研究较少，一般与膜运输等功能有关，它具有3 种同型[9]，为PI3KC2α、PI3KC2β 和 PI3KC2γ，分别由PIK3C2A、PIK3C2B 和PIK3C2G 基因编码，其中，PI3KC2α 和PI3KC2β在生物体内表达较广泛，但PI3KC2γ表达仅限于肝、前列腺和乳腺。Ⅲ型PI3K 主要与细胞自噬、囊泡运输、胞吞作用有关，只包含Vps 34（vacuolar pro⁃tein sorting 34）[10-13]，在肾小球脏层细胞中缺乏Vps 34，则会导致异常的细胞膜形态和脏层细胞功能障碍[14]。

蛋白激酶B即AKT，主要存在于胞浆，通过调节细胞生长因子促进细胞存活，并通过抑制促凋亡蛋白的失活来阻止细胞凋亡，包括三种同型AKT1（ PKBα）、AKT2（ PKBβ）、AKT3（ PKBγ）[15]。AKT是PI3K主要的下游靶点，通过跨膜转运及PI3K对磷脂酰肌醇环上第3 位羟基的特异磷酸化而活化，并使其底物磷酸化，作用于下游靶蛋白，从而调节细胞生物活动[16，17]。

2 PI3K/AKT 信号通路作用机制

在正常生理状态下，PI3K 在细胞内的表达水平很低，但当细胞损伤时，PI3K会被RTK、GPCR 激活，其表达水平快速升高。Gan 等[18]研究显示，当组织缺氧2 h和6 h 时，PI3K、AKT、MAPK 等信号通路均会被激活。PI3K 的p85 调节亚基被募集到临近质膜的部位，p110亚基通过与p85亚基结合，导致PI3K活化，磷酸化磷脂酰肌醇PI 的第3 位碳原子，促使细胞膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转变为信使蛋白－3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[19]。PIP3 作为第二信使[20]，招募含有PH结构域的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）和AKT信号蛋白，三者之间互相结合，使AKT从细胞质转移到细胞膜上，并在PDK1 和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-2（PDK2）的辅助下，磷酸化AKT蛋白上的两个位点：一个为苏氨酸磷酸化位点（Thr308），另一个为丝氨酸磷酸化位点（Ser473）[21-23]。接着，AKT不仅能够磷酸化TSC1/2[24]，活化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammali⁃an target of rapamycin，mTOR），还能作用于细胞周期蛋白依赖性激酶（cycling dependent kinase ，CDK）的抑制分子P21 和P27，增强细胞增殖[25]，并且能够激活核转录因子抑制蛋白激酶（IKB），使核转录因子κB（nu⁃clear factor kappa-B，NF-κB）的抑制剂降解，促进NFκB进行核转位，激活下游靶基因，起到抗炎作用，抑制细胞凋亡[26]（如图1）。

图1 PI3K/AKT 信号通路示意图

3 PI3K/AKT 信号通路对肌卫星细胞的影响

PI3K/AKT 信号通路能够调控多种细胞的生长和存活，产生相应的生物学效应。骨骼肌的损伤修复主要依赖肌卫星细胞的增殖分化。肌卫星细胞由Mauro发现[27]，是分布于肌细胞基底膜和肌膜间的成体干细胞，像卫星一样排列于肌细胞的周围，离体培养时称为成肌细胞。这类细胞在骨骼肌正常时处于静止状态，损伤发生时则被激活[28]，具有自我复制和多向分化的潜能，能够进一步增殖分化，相互之间融合成新的肌管或与损伤的肌纤维直接融合修复，进而治疗临床骨骼肌损伤[29，30]，在骨骼肌损伤修复过程中占有十分重要的地位。因此，如何募集到更多肌卫星细胞参与调节骨骼肌再生修复，减少肌肉组织血肿和纤维瘢痕形成，提高骨骼肌损伤的恢复质量值得关注。

骨骼肌成肌分化抗原（myogenic differentiation an⁃tigen，MyoD）属于肌源性调节因子（MRFs）蛋白家族，对调节动物的肌肉分化起着重要作用[31]。在正常静止状态的卫星细胞中，MyoD 的表达基本上无法检测到，而当处于运动或肌肉损伤状态时，MyoD的表达会被激活[32]。研究证实[33]，当骨骼肌无损伤状态时MyoD 阳性细胞核位于肌细胞边缘，当损伤后，其主要在细胞外基质中表达并且逐渐聚集于受损骨骼肌纤维和新生肌纤维周围。刘通[34]在体外分离培养多裂肌卫星细胞并用电针血清干预，结果发现电针血清组PI3K、AKT、mTOR的表达水平均高于正常组，应用PI3K抑制剂LY294002后，抑制剂组的指标表达明显降低，并且MyoD 的表达也明显低于电针血清组。因此可以得出结论，电针可促进MSCs 的增殖，在细胞周期的G1/S 期时PI3K 磷酸化激活p-AKT（Ser473），可进一步引起mTOR 的磷酸化，促进肌卫星细胞增殖与成肌分化。

Ding 等[35]研究原代培养颏舌肌成肌细胞在缺氧状态下的氧化损伤和细胞凋亡，结果发现低氧状态下24 h、48 h 时，PI3K、AKT 表达水平显著下降，应用染料木素（一种植物激素）后能部分保护成肌细胞不受缺氧导致的氧化应激损伤，并且此种保护作用是通过染料木素激活PI3K/AKT 信号通路调控B 淋巴细胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）基因、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）介导的。另有研究[20]发现，PI3K/AKT 通路参与周期性张应力诱导的成肌细胞凋亡，研究应用PI3K 抑制剂LY294002 通过Hoechst33258 荧光染色观察成肌细胞凋亡，结果发现施加相同的周期性张应力时，抑制剂组成肌细胞比相同时间下未加抑制剂组的凋亡细胞数目增多，即PI3K/AKT通路能够拮抗细胞凋亡。正常条件下，磷酸化的AKT 可以与下游底物糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）结合，使GSK3β磷酸化失活，灭活的GSK3β与肌核生长以及生肌细胞分化相关联，促进生肌细胞增殖分化[36]，因此PI3K/AKT 信号通路可能具有抑制成肌细胞凋亡的作用。

4 PI3K/AKT 信号通路对骨骼肌再生的影响

当骨骼肌发生损伤时，PI3K/AKT 信号通路的蛋白表达水平会发生变化。有研究[5]显示，通过调控PI3K/AKT/mTOR 通路能够促进肌生成，PI3K 蛋白激酶级联反应后激活AKT，AKT对下游mTOR产生调控作用，并作为介质调控多种细胞生长和存活过程，从而使PI3K/AKT/mTOR 信号通路及相关生物学功能更加活跃[37]。Matheny 等[38]将钢探针置于小鼠胫骨前肌腹部，冷却至-79℃，持续5 s或10 s至肌肉损伤，结果发现，无论是5 s 还是10 s 损伤，胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、PI3K、AKT的表达均明显高于未损伤对照肌，且10 s 损伤组检测指标的表达明显高于5 s 损伤组。即在小鼠骨骼肌损伤早期肌肉再生过程中，IGF/PI3K/AKT 通路部分组分的转录表达会被激活而表达升高，表达程度与损伤程度有关。

应用干预措施治疗骨骼肌损伤时，PI3K/AKT 信号通路蛋白表达会发生相应变化，且变化趋势与骨骼肌损伤修复的趋势相一致。张安宁等[39]研究应用West⁃ern blot方法比较正常组和损伤组各个时间点的PI3K、AKT、mTOR、p-AKT（Ser473）和p-mTOR（Ser2448）的表达水平，结果发现损伤组出现了表达水平先升高后降低的趋势，并且各项指标于损伤后5 d 达高峰。应用RT-PCR 观察发现，MyoD 和肌细胞生成素（myo⁃genin，MyoG）等促进成肌作用的指标也呈现先升高再下降的趋势，于损伤后3 d达高峰。并且HE染色可观察到损伤后3 d和5 d时，已出现新生的肌卫星细胞和肌管，表明PI3K/AKT信号通路的表达水平变化与骨骼肌损伤修复情况变化趋势一致，在时间上存在一定的相关性，即该通路能够在一定程度上调节MSCs的增殖分化。有研究[3，40]显示，失神经骨骼肌萎缩大鼠通过电针治疗后其PI3K蛋白的表达上调，电针组与对照组相比PI3K、AKT 以及mTOR 基因转录水平显著升高，磷酸化后的AKT 促进mTOR 表达增加，其可能通过调控p70S 激酶（p70S6K）[3]促进MSCs 增殖、蛋白合成、肌肉肥大。

PI3K/AKT 通路不仅能够促进骨骼肌相关蛋白合成，还能抑制肌蛋白降解，对骨骼肌线粒体起到保护作用。Zhang 等[41]研究发现，应用药物治疗骨骼肌萎缩，能够提高PI3K、AKT以及mTOR的磷酸化水平，并且能够促进C2C12 细胞PI3K/AKT 信号通路中蛋白的表达。当应用PI3K抑制剂作用于p110催化亚基时，可以在体内和体外消除药物的作用，说明骨骼肌萎缩的修复可能与PI3K/AKT 信号通路有关。有研究[42]阐述磷酸化的AKT 能够抑制泛素蛋白连接酶E3s（ubiquitinligase enzymes E3s）的合成，对肌蛋白的降解起到阻碍作用，从而延缓肌肉萎缩进程。Zhuang等[43]研究发现，人参皂苷显著增加AKT2 和Nrf2 mRNA 的表达，促进AKT 磷酸化，诱导Nrf2 核易位，上调抗氧化酶表达，增加了骨骼肌超氧化物歧化酶活性。刘绍东等[44]设置正常组、力竭运动组和有氧运动组研究有氧运动对骨骼肌线粒体的影响，结果显示，与一次性力竭组相比，有氧耐力训练组大鼠的基质金属蛋白酶（matrix metallo⁃protinase，MMP）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydroge⁃nase，SDH）和环氧化酶（cyclooxygenase，COX）活性水平、磷酸化PI3K 和磷酸化AKT 蛋白水平均显著升高，表明有氧耐力训练可以提高大鼠抵抗骨骼肌线粒体损伤的能力，对骨骼肌线粒体具有保护作用，其机制可能与活化PI3K/AKT信号通路有关。