肌生成抑制素（MSTN）抗体对肩袖撕裂后肌肉退变的治疗效果

林金榕 田家齐 孙亚英 罗家宇 陈闻波 刘少华 陈疾忤

1 复旦大学附属华山医院运动医学科（上海200040）

2 复旦大学附属华山医院放射科（上海200040）

3 复旦大学上海医学院临床医学（上海200040）

肩袖撕裂是一种导致肩部疼痛、肩关节活动范围受限甚至肢体障碍的常见疾病。关节镜下修复肩袖撕裂是目前治疗的主要手段，取得了较为满意的临床疗效[1，2]。然而，对于巨大肩袖撕裂（massive rotatorcuff⁃tear，MRCT）患者，术后肩袖的愈合和功能恢复仍然是巨大挑战。MRCT患者常常伴有肌腱回缩、肌肉退变等多种病理改变[3-5]。在这些因素中，肌肉退变是已经明确的导致肩袖再撕裂和术后不良预后的危险因素[6，7]。肩袖肌肉退变包括肌纤维萎缩、组织纤维化、脂肪浸润伴肌内脂肪细胞积聚[8]。在晚期病例中，90%的纤维束表现出部分退行性特征，超过一半的活检样本完全不含肌纤维[9]。因此，肌肉退变的肩袖术后功能不佳，并且肌肉退变导致的肌肉高张力使得肩袖再撕裂率较高[10]。

肌生成抑制素（myostatin，MSTN），也被称为生长分化因子8（growth differentiation factor 8，GDF8），属于转化生长因子β （transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员，于1997年在小鼠体内首次发现[11]。据报道，MSTN 对肌肉生长发育有负调控作用，它与肌肉损失和退变密切相关[12]。MSTN 通过与膜受体结合，上调包括肌肉特异性环指蛋白1（muscle-specif⁃ic RING finger protein 1，MuRF1）和 肌萎缩蛋 白Fbox-1（muscle atrophy Fbox-1，Atrogin1）在内的分解代谢蛋白[13]，下调包括磷酸化蛋白激酶（phosphorylat⁃ed AKT，p-Akt）在内的合成代谢蛋白[14]，从而导致肌肉损失。

以往有研究报道拮抗MSTN 策略在肌肉损失相关疾病中的作用[15，16]，尚未见研究探讨拮抗MSTN策略在肌萎缩、纤维化、脂肪浸润等肌肉退变中的作用。本研究探讨MSTN 抗体在小鼠肩袖撕裂模型中对抗肌肉退变的能力。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立

10周龄雄性C57BL/6小鼠18只，体重22.8 ±1.39 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号SCXX（沪）2012-0002。所有动物实验均按照动物饲养和使用的指导原则进行，实验方案经当地动物饲养委员会批准。研究设计流程如图1所示。

图1 研究设计流程图

按照既定方案，建立小鼠MRCT 模型诱导冈上肌退变[17]。在2%异氟醚氧全身麻醉下，用一次性使用解剖器（北京博海康源医疗器械有限公司）横切切断左肩冈上、冈下肌腱和肩胛上神经。同时，对另外6只小鼠的左肩进行假手术。在6 只行假手术小鼠中，逐层切开皮肤和肌肉，识别冈上、冈下肌腱及肩胛上神经，然后缝合关闭切口[17]。术后连续3 天给予0.05 mg/kg 丁丙诺啡控制疼痛。

在手术后3周，即出现肌肉萎缩、纤维化和脂肪浸润时[17]，将12 只MRCT 老鼠随机分为注射MSTN 抗体（AF788，明尼苏达州研发公司，美国）组（抗MSTN 组）和注射磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）组（PBS组）。注射过程中，吸入异氟醚麻醉后，触诊肩胛骨和肩胛脊。抗MSTN 组和PBS 组分别用10 μL 的汉密尔顿注射器和25 号针头在左冈上肌撕裂部位从前向后三个点分别注射10 μL的20 mg/kg 的MSTN 抗体溶液和PBS 溶液[18]。注射的程序和剂量参考既往的研究[19]，从术后第4周第1天至术后第6周第1天，每周注射1 次（共3 次）。进行假手术的6 只小鼠均未接受注射，设为正常对照组（假手术组）。

根据我们的初步数据和已经发表的证据[20]，基于检验效能1-β=0.80和检验水准α=0.05的功效分析，每组6 只小鼠足以证明PBS 组和抗MSTN 组预估的15%的差异。

1.2 磁共振成像（MRI）

术后第7周第1天，在麻醉状态下用3.0T水平磁铁（Discovery MR750；通用电气医疗集团，美国）和60 mm 直径梯度线圈（江阴万康医疗科技，中国）对麻醉下小鼠冈上肌进行MRI 测量。采用3D 梯度回波成像序列对所有动物进行T1WI 图像的多片扫描（30 片，1 mm 片厚，1 mm 片间距离）。重复时间（TR）和回声时间（TE）分别为12 ms 和6 ms。图像使用6×6 cm 视野大小和256×256 矩阵生成。扫描时间为3 分钟。MRI确定肱骨头后，于第三平面得到冈上肌横截面（CSA）。使用Image J 软件（美国国立卫生研究院）对冈上肌横截面积进行定量，并根据PBS 组结果进行标准化处理。

1.3 肌肉宏观指标测量

MRI检查后，立即将小鼠颈椎脱臼安乐死，取左肩冈上肌。肌肉分离后立即测定冈上肌的湿重，并根据术后第7 周第1 天小鼠体重，标化冈上肌重量，得到标化后的冈上肌重量。测量冈上肌肌肉的长度（l）、宽度（w）、高度（h）等参数。冈上肌肌肉体积估计值（v）假设为椭球体，计算公式为[21]：

1.4 组织学分析

上述观察后，立即将肌肉组织在4%多聚甲醛中固定24 h，经乙醇梯度脱水后，将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，冷却后将蜡块置于切片机上，切成4 μm厚的切片。分别进行苏木精伊红（HE）染色和马松（Masson）染色[22，23]。通过倒置光学显微镜（IX71SBF2；Olympus，东京，日本）和DP72 数码成像装置（Olym⁃pus）观察组织切片。在同一样本的5 张HE 切片上测量，得到中位肌纤维横截面积（CSA）。在HE切片中用总肌纤维面积与脂肪空泡面积的比值计算相对值，得到脂肪浸润率。根据Masson染色上胶原阳性面积与总肌纤维面积的比值计算相对值，得到反映纤维化的脂肪浸润率。结果根据假手术组进行标准化处理。使用Image J 软件（美国国立卫生研究院）对来自同一样本的5张切片的胶原沉积和脂肪空泡进行定量。

1.5 免疫组织化学观察

为了进一步分析MSTN 抗体对肌肉萎缩和纤维化的影响，我们利用免疫组化将分解代谢标志物（MuRF1和Atrogin1）和合成代谢标志物（p-Akt）定位于肌纤维并进行定量分析；分别通过Masson染色和α-SMA免疫组化测定胶原沉积程度和肌成纤维细胞，并进行定量分析。免疫组化分析按照既定的方案进行[24]，4 μm石蜡包埋的组织切片在二甲苯-脱蜡，而后在梯度酒精/水中系列中再水化。紧接着用一抗孵育1小时，用PBS溶液洗涤3 次，用对应的结合辣根过氧化物酶的二抗在室温下孵育30 分钟，然后再用PBS 溶液洗涤3 次。使用的抗体包括p-Akt抗体（bs-0876R，博奥森生物，中国）、MuRF1 抗体（bs-2539R，博奥森生物，中国）、Atrogin1 抗体（bs-2591R，博奥森生物，中国）、α-SMA 抗体（ab124964，Abcam，美国）和山羊抗兔IgG H&L（ab6721，Abcam，美国）。使用Image J 软件（美国国立卫生研究院）对来自同一样本的5 张切片的免疫组化阳性区域进行灰度值量化分析。

1.6 统计分析

数据以均数± 标准差表示。组间差异通过方差分析确定，然后在Graphpad Prism 5（圣地亚哥，美国）上进行事后Bonferroni 检验。P<0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 影像学结果

与假手术组相比，PBS组和抗MSTN组的冈上肌横截面积均显著降低（P<0.001），且抗MSTN 组冈上肌横截面积显著高于PBS 组（P<0.05）（图2），说明MSTN 抗体延缓了萎缩的进展。

2.2 宏观观测结果

各组冈上肌的代表图如图3 所示。3 组的冈上肌形状有显著差异。术后6周，冈上肌重量、标化后的重量和体积，PBS 组和抗MSTN 组均显著低于假手术组（P<0.001），同时PBS组显著低于抗MSTN组（P<0.001）（表1）。

图2 冈上肌横截面积磁共振成像结果

图3 三组冈上肌的代表性图像

表1 术前及术后6周小鼠体重，术后6周冈上肌重量、标化后的重量和体积

2.3 组织学和免疫组化结果

HE 染色显示，与假手术组肌纤维相比，PBS 组和抗MSTN 组的冈上肌均有较多的纤维，且纤维区域不均匀，细胞核集中，提示肌腱和神经切除后发生肌肉萎缩和生长过程，结果与既往研究一致[25，26]。抗MSTN组中肌纤维横截面积（1576.40 ± 674.18 μm2）显著高于PBS 组（1309.91 ± 638.19 μm2，P<0.05），但仍显著低于假手术组（1946.37 ± 586.58 μm2，P<0.001）。与之相应的，抗MSTN组中的脂肪浸润面积显著低于PBS组（P<0.01），但仍然高于假手术组（P<0.001）（图4）。

由图5 可知，与PBS 组相比，MSTN 抗体注射后显著抑制了MuRF1 和Atrogin1 的上调表达（均P<0.001）。另一方面，与PBS组相比，抗MSTN组中p-Akt水平显著提高（P<0.001），但仍低于假手术组。结果表明，注射MSTN 抗体能延缓肌腱和神经横断后导致的冈上肌萎缩。

由图6 可知，无论是否注射MSTN 抗体，肌腱和神经切除术后的胶原沉积程度和α-SMA阳性区域均显著高于假手术组。但胶原沉积程度和α-SMA阳性区域在抗MSTN 组都低于PBS 组（均P<0.001），这一结果表明MSTN抗体具有抑制纤维化的作用。

3 讨论

本研究的主要发现是：MSTN抗体注射能有效地阻止肌肉萎缩，抑制MRCT 小鼠模型的肌肉纤维化和脂肪浸润。

多种细胞参与了肌肉退变的过程，包括肌细胞、成纤维细胞/肌成纤维细胞和纤维脂肪前体细胞等。并且TGF-β信号通路在各种细胞类型中均被激活[27]，因此直接拮抗TGF-β信号通路的激活对于肌肉退变具有治疗潜力。Davies 等报道给予TGF-β受体1 抑制剂SB431542 可以预防肩袖撕裂后肌肉的退变[28]。MSTN属于TGF-β超家族，与TGF-β共享多个信使[29]，因此具有治疗潜力。本研究证实了MSTN 抗体注射在治疗肌肉萎缩，纤维化和脂肪浸润中的作用。

既往研究通过切断肩袖肌腱和肩胛上神经，建立小鼠肩袖撕裂后的肌肉退变模型，术后2 周即出现明显的萎缩、纤维化和脂肪浸润[28]。本研究在术后6周时也发现了明显的肌肉退变。Kuenzler等[10]报道，在肩袖肌腱和肩胛上神经切断术后6 周，冈上肌的平均重量降至12.3 mg，本研究中降至11.12 mg。这些结果表明了该模型建立的可重复性。

图4 HE染色及肌纤维平均横截面积、脂肪浸润的定量分析结果

图5 肌纤维MuRF1、Atrogin1和p-Akt的免疫组化染色及定量分析

图6 肌纤维Masson染色、α-SMA免疫组化及定量分析

基于该模型的可靠性，我们进一步探究了MSTN抗体注射对肌肉退变的影响。影像学和组织学检查结果表明MSTN 抗体注射可提高冈上肌的横截面积、肌肉重量和肌肉体积，证实了其抗萎缩作用。这些结果与人类组织中观察到的结果一致[9，30]。由于肌肉萎缩是蛋白质合成与降解之间的失衡，因此我们分析了肌纤维中与萎缩和肥大相关蛋白的表达。MSTN 通过叉头转录因子O1（FOXO1）上调两个主要的与萎缩相关的泛素连接酶MuRF1 和Atrogin1[31，32]。FOXO1 还可以抑制肌肉合成代谢所需的Akt 的激活[33]。总的来说，MSTN 使合成代谢和分解代谢失衡，进而导致肌肉萎缩。通过本研究的免疫组化结果可知，MSTN抗体通过增加肌纤维中p-Akt的表达、降低MuRF1和Atrogin1的表达，阻止肌肉的萎缩。

除了上述抑制肌肉萎缩的作用，MSTN抗体注射还能影响纤维化的形成[34]。胶原沉积阻碍肌肉再生，并削弱肌肉功能[35]。作为TGF-β超家族的成员，MSTN与受体ActRIIB 结合并激活下游Smad 蛋白，进而通过α-SMA阳性的肌成纤维细胞启动纤维化过程[36，37]。在本研究中，MSTN抗体注射后，胶原沉积和α-SMA 阳性的面积显著降低，表明MSTN 抗体具有抑制纤维化的作用。

本研究具有以下优点。首先，采用免疫组织化学染色法，而不是简单地通过免疫印迹法来测量蛋白的表达，从而实现了目标蛋白的定位。不同的细胞甚至对同一种蛋白也有不同的反应。例如，Akt的激活促进了肌纤维的肥大，但在成纤维细胞中可能起促纤维化的作用[38]，因此，测量整个组织的蛋白水平并不具有代表性。其次，为了模拟临床实践，本研究用MRI来评估冈上肌的横截面积。虽然二维MRI在描述肩袖肌肉退变方面的可靠性受到质疑[39]，但是本研究进一步测量的冈上肌重量和体积等结果提示本研究的结果是可靠的。本研究也有一些局限性，例如无法测量小鼠肩袖冈上肌的肌力。MSTN 抗体治疗对其他细胞群的影响还需要进一步研究来确定。

4 结论

MSTN 抗体注射可减轻小鼠巨大肩袖撕裂后的冈上肌萎缩、纤维化和脂肪浸润。