针刺干预对大鼠离心运动性骨骼肌损伤后线粒体分裂的影响

2021-01-29白胜超陈圣菊尚画雨李俊平周越王瑞元

中国运动医学杂志 2020年11期

白胜超陈圣菊尚画雨李俊平周越王瑞元

1 南京理工大学体育部（江苏南京210094）

2 北京体育大学运动人体科学学院（北京100084）

3 成都体育学院运动医学与健康学院（四川成都610041）

长时间进行大负荷或不习惯的离心运动后，骨骼肌会出现僵硬酸痛、肌力下降、超微结构改变等现象，造成运动性骨骼肌损伤，导致运动能力降低，影响正常的生活或运动训练[1]。在运动以及恢复过程中，线粒体作为重要的能量代谢细胞器发挥着重要作用，因此，本课题组前期对线粒体的损伤进行了研究，发现运动会引起骨骼肌线粒体结构改变，出现大小不一、嵴稀少或空泡化、肌膜下聚集等现象[2]；大负荷离心运动后会出现线粒体自噬和细胞凋亡现象[3-4]。有研究指出，线粒体损伤会引起线粒体分裂，而线粒体分裂是导致线粒体自噬和细胞凋亡的重要原因[5-7]，同时粒体分裂增强会使网状结构发生断裂，片段化线粒体增多，活性氧类物质大量产生，导致线粒体功能降低。因此，本研究推测，在进行大负荷离心运动后，骨骼肌线粒体可能会出现分裂现象，随后引起线粒体自噬和细胞凋亡，导致线粒体功能下降。

针刺作为传统治疗方法，能够明显降低运动性骨骼肌损伤程度[8]，促进机能恢复且治疗效果显著[9]，有效降低运动后升高的肌张力并改善肌肉疲劳，缓解延迟性肌肉酸痛等运动后的不良反应，促进恢复[10-11]。针刺能够降低运动后骨骼肌线粒体损伤程度，并对线粒体自噬和细胞凋亡现象起到明显的改善作用[3-4]。这提示：运动后进行针刺干预可能影响线粒体的分裂，进而降低线粒体自噬和细胞凋亡，从而促进骨骼肌功能的快速恢复。

运动后的针刺干预已有相关研究，但从骨骼肌线粒体分裂角度进行的探讨和研究还相对较少，另外，由于线粒体在运动后一直处在较高的活动水平，有必要进行多时相的检测，而目前还缺少对离心运动后线粒体多时间点的连续监测。线粒体外膜转位酶20（trans⁃locase of outer membrane 20，TOMM20）为线粒体膜的标志蛋白，可以定位线粒体位置；线粒体分裂动力相关蛋白1（dynamin-relatedprotein1，DRP1）为线粒体分裂相关的重要蛋白；FUNDC1 蛋白（FUN14 domain con⁃taining 1，FUNDC1）为线粒体分裂过程中的关键作用蛋白。因此，本实验对大鼠进行一次性大负荷离心运动并针刺干预，观察比目鱼肌线粒体的超微结构变化，检测TOMM20 与DRP1 的共定位、FUNDC1 与DRP1 的相互作用，共同确定线粒体分裂情况，以及检测DRP1蛋白表达水平确定分裂程度，从而探究大负荷离心运动后骨骼肌线粒体的分裂情况及针刺作用效果。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

8周龄雄性SD 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（使用许可证号：SCXK 京2012-0001），SPF 级别，共计176 只，体重220 ± 9.3g。大鼠饲养环境：温度23.5℃± 3.5℃，相对湿度45%～65%，灯光照射为12 h 明暗交替，所有大鼠均为自由进食、饮水。大鼠在北京体育大学标准动物房内分笼饲养。本研究获得伦理委员会批准。

所有大鼠在标准动物房内适应性饲养3 天，之后随机分为安静对照组（C 组）、单纯针刺组（A 组）、单纯运动组（E 组）、运动针刺组（EA 组），E、EA 组进行一次性下坡跑离心运动，A、EA 组进行针刺干预。其中A、E、EA 组根据实验要求又分为0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时相亚组，每小组8只，详见表1。

表1 实验动物分组（n=8）

1.2 运动方案

模型的预适应期参照赵晓琴的方案进行[4]，为期3天，方式为：单纯运动组大鼠在小动物电动跑台上进行规定速度的运动，第1 天跑台坡度为0°，速度为16 m/min，训练5 min；第2 天跑台坡度为0°，速度为16 m/min，训练10 min；第3 天休息。正式实验运动方案参照Armstrong[12]经典离心运动方式，并参照文献[13]，构建大鼠比目鱼肌运动性骨骼肌损伤模型，参数为：坡度－16°，速度16 m/min，时间90 min。

1.3 针刺方案

具体方案采用丁海丽方法进行[14]，单纯针刺组、运动针刺组进行比目鱼肌斜刺，其中单纯针刺组不进行运动，直接在安静状态下针刺。将大鼠固定好后，小腿三头肌位置进行消毒，用0.25 mm针灸针[汉医牌，津食药监械（准）字2009第2270002号]从远端进针，沿比目鱼肌的位置走向进行30°斜刺，并在肌腹部位留针2 min。

1.4 样本采集

在每组相应的时间点进行比目鱼肌取材，每只大鼠电镜、免疫共沉淀、免疫荧光的样本均取自同一块骨骼肌。电镜样本：取体积约为1 mm3的比目鱼肌，置于4℃预冷的2.5%戊二醛固定液中备用。免疫共沉淀样本：取比目鱼肌锡纸包裹，转移到－80℃冰箱中储存备用。免疫荧光样本：取体积约为16 mm3的比目鱼肌，OCT 包埋后存于－80℃冰箱备用。线粒体样本：取100 mg比目鱼肌，根据线粒体分离试剂盒（中国，碧云天公司）的说明书进行提取操作，之后加入储存液转存备用。

1.5 测试指标与方法

1.5.1 透射电子显微镜观察骨骼肌线粒体超微结构的变化

磷酸盐缓冲液冲洗样品。锇酸固定后梯度酒精脱水。环氧树脂包埋后切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色液染色。样本充分干燥后通过透射电子显微镜进行结构观察，电镜（×2000～8000）随机进行拍摄，采集图像。

1.5.2 免疫荧光检测骨骼肌线粒体TOMM20/DRP1的共定位

冰冻切片机进行切片。丙酮液固定。PBS 清洗后滴加5%的羊血清封闭，37℃孵育30 min。滴加5%羊血清稀释的一抗TOMM20（英国，Abcam 公司）与DRP1（英国，Abcam公司），稀释比例1︰400，4℃冰箱孵育过夜。移除一抗，PBS 清洗后滴加5%羊血清配制的二抗（中国，伊莱瑞特生物科技股份有限公司），比例1︰250，室温避光孵育2 h。移除二抗，PBS 清洗后滴加DAPI 封片。激光共聚焦设置波长为488 和555 两种，随机采集视野，IPP6.0软件进行分析，统计两种蛋白的共定位百分数。

1.5.3 免疫共沉淀测定骨骼肌FUNDC1/DRP1 等蛋白的相互结合作用

比目鱼肌加入IP 裂解液，进行剪碎匀浆并离心（12000 g、4℃、10 min）。蛋白稀释至1 μg/μl，将1 ml样品中加入1 μl的兔IgG抗体，再加入20 μl珠子，4℃环境下缓慢混匀2 h，使其进行均匀结合。离心（14000 g、4℃、10 min），取上清，弃沉淀。加入FUNDC1 抗体（美国，Millipore 公司），并设置阴性对照组，4℃过夜。加入30 μl 的protein A/G-beads，4℃冰箱孵育2 h，之后离心（14000 g、4℃、10 min），将离心后的沉淀保留，并进行清洗，再加入蛋白上样缓冲液，95℃煮5 min，保存待测。Western Blot 检测DRP1 蛋白量。

1.5.4 Western Blot测定线粒体DRP1

比目鱼肌剪碎匀浆并离心（12000 g、4℃、10 min），上清液和线粒体样品分别用BCA 试剂盒进行蛋白定量，加入样品缓冲液，煮沸5 min 保存。加入样品。电泳80 V恒压。300 mA恒流转膜。5%BSA室温摇床封闭2.5 h。滴加封闭液稀释的一抗，稀释比例为DRP1（1︰800）（英国，Abcam 公司），线粒体内参COXⅣ（1︰2000），4℃过夜。TBST 清洗后滴加对应的二抗（中国，中衫金桥），浓度均为1︰6000，孵育2 h。TBST清洗后滴加发光液放入成像系统采集图片。Gel-pro软件进行分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS20.0 统计软件进行分析，所得数据均以平均数± 标准差（±s）表示。对处理方式（运动、针刺）和时相因素（0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）采用双因素方差分析进行检验，若处理方式的主效应显著则进一步执行安静对照组、单纯针刺组、单纯运动组、运动针刺组等组间的事后多重检验。各因素内的各个亚组比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 运动及针刺干预后不同时相骨骼肌线粒体超微结构的变化

骨骼肌线粒体微观结构观察的结果详见图1。安静对照组（图a、b）骨骼肌线粒体均匀分布于“Z”线两侧，通过电子密度体衔接，呈串状分布于肌原纤维之间，线粒体形态标准，未见明显的损伤情况和线粒体片段。单纯针刺组（图A0～A72）线粒体在针刺后的0～72 h 并未见明显变化，形态完整。单纯运动组（图E0～E72）线粒体在E2组和E6组中结构出现肿胀，已有少量的线粒体细小片段；E12组明显增多，存在较多大小不一的线粒体片段，部分线粒体膜结构模糊，并出现大量积聚；E24组细小线粒体数量较多，结构不清晰且肿胀；E48 组线粒体细小片段数量减少；E72 组略有缺失，但结构已趋于完整。运动针刺组（图EA0～EA72）线粒体EA2、EA6组分别与E2、E6组的变化类似，EA12组线粒体同样出现较多细小片段，但程度明显要小于E12组，EA24 组线粒体片段化数量要少于E24 组，EA48 组仅有少量的线粒体片段存在，且结构已逐渐恢复，EA72组与安静对照组相似。

图1 运动及针刺后不同时相线粒体变化情况

2.2 运动及针刺干预后不同时相下TOMM20/DRP1共定位变化

见图2。使用激光共聚焦显微镜采集图像，TOMM20为线粒体膜的标志蛋白，DRP1为线粒体分裂的标志蛋白，TOMM20 和DRP1 发生共定位呈黄色，说明DRP1 蛋白从胞浆转位到线粒体。安静对照组（图C）未见明显的黄色荧光。单纯针刺组（图A0～A72）与安静对照组相比，未见明显区别，在A12组偶见黄色荧光颗粒。单纯运动组（图E0～E72）运动后黄色荧光逐渐增多增亮，并在12～24 h 达到峰值，之后开始减少，在E72 组尚能见到黄色荧光。运动针刺组（图EA0～EA72）变化趋势与单纯运动组相似，但在峰值12～24 h 能明显发现黄色荧光弱于单纯运动组的12～24 h，在EA72组几乎未见明显的黄色荧光结合点。

采用IPP6.0 软件对图像进行分析，统计两种蛋白的共定位百分数（表2）。通过双因素方差分析对处理因素（运动、针刺）进行主效应检验，结果显示存在显著影响（P<0.01）。事后多重检验结果显示，安静对照组和单纯针刺组无显著性差异（P>0.05）；单纯运动组高于安静对照组（P<0.05）；运动针刺组高于安静对照组和单纯针刺组（P<0.05），但显著低于单纯运动组（P<0.05）。

单纯针刺组组内各时相点之间相比无显著性差异（P>0.05）；组间相比，各时相点与安静对照组相比未见显著性差异（P>0.05）。

单纯运动组组内各时相比较：运动后0 h、2 h 分别与6 h、12 h、24 h、48 h 等相比，具有显著性差异（P<0.01）。运动后6 h、12 h、24 h、48 h 分别与72 h相比，具有显著性差异（P<0.01），其余时相间相比均无显著性差异（P>0.05）；组间比较：与安静对照组相比，运动后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 均具有显著性差异（P<0.01）。

运动针刺组组内各时相比较：运动后0 h 与6 h、12 h、24 h、48 h，2 h 与6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，6 h 与12 h、72 h，24 h 与48 h、72 h，以及48 h 与72 h等相比均具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；组间比较：与安静对照组相比，运动后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 等时相比值均有显著性差异（P<0.05），与单纯针刺组相比除72 h 外其余所有时相均具有显著性差异（P<0.05），与单纯运动组相比各时相无显著性差异（P>0.05）。

表2 运动及针刺后不同时相线粒体TOMM20/DRP1共定位比值（n=8）

2.3 运动及针刺干预后不同时相FUNDC1/DRP1 结合的变化

FUNDC1 为线粒体蛋白，能够与胞浆中的线粒体分裂蛋白DRP1 发生结合，导致线粒体分裂，采用Gelpro分析软件对蛋白图像进行分析，两者出现共沉淀说明转位到线粒体上的DRP1 蛋白发挥了分裂作用。不同时相FUNDC1与DRP1结合的比值变化见表3。

通过双因素方差分析对处理因素（运动、针刺）进行主效应检验，结果显示存在显著影响（P<0.01）。事后多重检验表明，单纯针刺组与安静对照组相比无显著性差异（P>0.05）；单纯运动组高于安静对照组（P<0.05）；运动针刺组明显高于安静对照组和单纯针刺组（P<0.05），但显著低于运动组（P<0.05）。

图2 各组不同时相下骨骼肌TOMM20/DRP1共定位

单纯针刺组组内各时相比较，2 h 和12 h 具有显著性差异（P<0.05），其余均无显著性差异；组间比较，各时相与安静对照组相比也未表现出差异（P>0.05）。

单纯运动组组内各时相比较：运动后0 h、2 h 分别与6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相比具有显著性差异（P<0.05 或P<0.01），运动后6 h 分别与12 h、24 h、48 h、72 h 相比具有显著性差异（P<0.01），运动后12 h、24 h、48 h、72 h 相互比较均具有显著性差异（P<0.05或P<0.01），其余时相间相比均无显著性差异（P>0.05）；组间比较，运动后6 h、12 h、48 h、72 h 显著高于安静对照组（P<0.05或P<0.01）。

运动针刺组组内各时相比较：运动后0 h、2 h 与6 h、12 h、24 h、48 h相比有显著性差异（P<0.05或P<0.01），6 h与12 h、24 h，12 h、24 h与48 h、72 h以及48 h 与72 h 相比也均有显著性差异（P<0.05 或P<0.01）；组间比较：6 h、12 h、24 h、48 h、72 h比值均显著高于安静对照组（P<0.05），2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 比值均显著高于单纯针刺组（P<0.01），2 h、6 h、12 h、24 h、72 时相比值与单纯运动组相比具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。

表3 不同时相FUNDC1与DRP1结合的比值变化（n=8）

2.4 运动及针刺干预后不同时相线粒体DRP1的变化

采用Gel-pro分析软件对蛋白图像进行分析统计，线粒体DRP1 蛋白的表达量是检测线粒体分裂程度的重要指标。不同时相线粒体DRP1的变化见表4。

通过双因素方差分析对处理因素（运动、针刺）进行主效应检验，结果显示存在显著影响（P<0.01）。事后多重检验表明，单纯针刺组与安静对照组相比无显著性差异（P>0.05）；单纯运动组高于安静对照组（P<0.05）；运动针刺组明显高于安静对照组和单纯针刺组（P<0.05），但与单纯运动组相比明显较低（P<0.05）。

单纯针刺组组内各时相比较，运动后12 h与0 h、2 h、6 h、48 h、72 h有显著性差异（P<0.05），其余未见明显差异（P>0.05）；组间比较，运动后12 h与安静对照组有显著性差异（P<0.05）。

单纯运动组组内各时相比较：运动后0 h 与6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，2 h 与6 h、12 h、24 h、48 h，6 h与12 h、24 h，12 h、24 h与48 h、72 h相比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；组间比较：运动后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 比值均显著高于安静对照组（P<0.05或P<0.01）。

运动针刺组组内各时相比较：运动后0 h、2 h 与6 h、12 h、24 h、48 h相比有显著性差异（P<0.05），6 h与12 h、24 h、72 h，12 h、24 h与48 h、72 h以及48 h与72 h相比也均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；组间比较：运动后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h比值均显著高于安静对照组（P<0.05 或P<0.01），所有时相均显著高于单纯针刺组（P<0.05或P<0.01），24 h、72 h显著低于单纯运动组（P<0.05）。

表4 不同时相线粒体DRP1蛋白表达量（相对于C组）（n=8）

3 讨论

线粒体是重要的细胞器，具有外膜、内膜双层膜结构，能够合成ATP为细胞提供能量[15]，并且与生物体的发育、凋亡、能量代谢等许多生命活动都具有重要关系[16]，维持着生物体众多的生理活动。线粒体作为一种动态变化的细胞器，不断通过分裂和融合进行信息交流，保持自身结构和功能稳定，以此来实现质量控制，维持自身动力学的平衡[17]，其中线粒体分裂决定线粒体形态、数量及分布，是影响其功能的重要原因[18]。在大负荷离心运动过程中以及运动后的恢复期，骨骼肌线粒体会出现不同程度的变化。有研究发现，运动后骨骼肌肌浆网肿胀，诱导微管解聚，影响线粒体形态，表现为出现严重的线粒体损伤，随后经初步检测DRP1的表达，发现DRP1 蛋白在运动后出现时相性变化[19]，提示骨骼肌线粒体可能发生分裂现象。本研究从线粒体分裂的角度进一步探究大负荷运动后针刺干预的作用机制，能够对微观层面有更为全面的了解，并对针刺在离心运动后骨骼肌线粒体损伤、分裂、自噬以及细胞凋亡方面的研究进行补充，形成系统的修复理论，提高对骨骼肌线粒体功能恢复和针刺作用机制的深层认识。

透射电镜能够观察到骨骼肌线粒体的超微形态，线粒体具有网状结构，在透射电镜下呈长条状或卵圆形[20]，长条状结构完整均匀，粗细一致，膜结构清晰完整；卵圆形则饱满规则，对称分布在“Z”线两侧。若在肌原纤维间出现大量的细小点状线粒体，为线粒体完整网状结构中分裂下来的片段，说明线粒体已发生分裂现象，可以作为线粒体分裂的直观证据[21，22]。在运动后骨骼肌线粒体的透射电镜研究中，孙良[23]对大鼠进行一次性力竭运动干预，并在不同时刻观察肱三头肌的超微结构，发现骨骼肌线粒体发生了不同程度的病理学变化，出现肿胀、空泡化、嵴模糊甚至消失等现象，但该研究未对运动后线粒体片段化进行观察。

本研究首先通过透射电镜对运动及针刺后的比目鱼肌线粒体进行超微结构观察，验证是否存在片段化现象。研究发现，单纯针刺并未引起线粒体数量明显的变化，而大负荷离心运动能够造成线粒体片段化，出现分裂现象，细小线粒体数目明显增多，12 h、24 h 达到峰值，并持续到运动后48 h，表明离心运动对线粒体形态和数量的影响至少持续至48 h；在运动后72 h出现明显恢复，但线粒体略有缺失，可能是由于后续线粒体自噬或线粒体的融合过程高于分裂过程所致。为了进一步验证透射电镜结果，本研究采用蛋白TOMM20与DRP1 进行免疫荧光双标实验，蛋白FUNDC1 与DRP1 进行免疫共沉淀实验进行验证。TOMM20 是典型的线粒体定位标志蛋白，DRP1是引起线粒体分裂的关键蛋白[24]，也是评价线粒体分裂的重要指标[25]，两种蛋白的共定位百分比增多表明线粒体分裂加强。FUNDC1 是一种在哺乳动物中高度保守的跨膜蛋白，定位于线粒体[26]，磷酸化的FUNDC1与DRP1结合介导了线粒体分裂和自噬的发生[27]，两种蛋白共沉淀增多说明线粒体分裂加强。两种实验结果的变化趋势均表明，单纯进行针刺组未发现骨骼肌线粒体明显分裂，单纯进行运动组可见分裂现象在运动后0 h 即逐渐增多，在运动后12 h 达到峰值，并持续至24 h，在48 h、72 h 明显降低。为了确定各组分裂程度，本研究对线粒体DRP1蛋白进行了检测。DRP1蛋白作为线粒体分裂的重要蛋白，大量存在于胞浆，通过与其他蛋白的相互作用转运至线粒体外膜上并聚集成点，在三磷酸鸟苷驱动下形成螺旋状结构，最终收缩线粒体进行切割，导致线粒体分裂，出现片段化[28]。Jamart 等[29]研究发现，在禁食状态下令小鼠以10 m/min速度进行90 min的低强度运动，在腓肠肌中发现ULK1、AMPK 磷酸化均未在运动后禁食和喂养两种条件下出现变化，由于ULK1、AMPK 为DRP1 上游蛋白，其磷酸化影响DRP1的表达，该研究也发现线粒体分裂标记蛋白DRP1在运动后出现明显增加。Ding 等[30]令大鼠进行150 min 的剧烈运动，发现在运动后即刻或恢复期，骨骼肌细胞中线粒体融合蛋白mRNA 的表达显著降低，线粒体分裂相关蛋白表达显著增加。刘慧君[31]令小鼠进行一次性中等负荷运动，发现蛋白DRP1 在运动后的60 min、90 min，其mRNA 水平以及蛋白的最终表达水平都升高，提示运动以及运动后骨骼肌线粒体有分裂趋势。以上研究皆表明，进行一定程度的运动可导致线粒体分裂。本研究提取了骨骼肌线粒体，并进行了蛋白表达水平的检测。DRP1变化趋势与透射电镜、免疫荧光共定位、免疫共沉淀结果一致，单纯进行针刺未引起线粒体明显分裂，进行大负荷离心运动后骨骼肌线粒体出现分裂现象；在12 h、24 h达到峰值，之后逐渐降低并持续到48 h，72 h已显著降低。

大负荷离心运动后针刺骨骼肌进行干预会对线粒体产生一定的影响。尚画雨[3]令大鼠进行一次性离心运动，并在运动后进行针刺干预，透射电镜下可明显观察到运动后线粒体损伤严重，自噬体增多，而进行针刺干预后自噬体显著降低，损伤较轻，并促进了线粒体的结构恢复。在本研究的透射电镜结果中，离心运动后进行针刺干预能够降低峰值时相线粒体的分裂程度，细小线粒体数量减少，且在12 h、24 h 峰值时相更为明显；同时在运动针刺后72 h 恢复效果更为显著，形态上与正常状态无异，说明针刺干预可促进线粒体结构的恢复，能够直接反映在微观结构上。TOMM20 与DRP1 的免疫荧光双标实验，蛋白FUNDC1 与DRP1 的免疫共沉淀实验结果显示，大负荷离心运动后进行针刺干预，总体变化趋势与单纯运动组基本一致，同样在12 h、24 h达到峰值，但整体来看线粒体的分裂现象得到明显改善，尤其是在峰值的时相点分裂明显降低。两部分实验结果与透射电镜下的观察结果一致，说明针刺干预可以改善运动所致的线粒体分裂现象。但需要指出的是，在单纯运动组和运动针刺组的结果统计上两种实验方法并不完全相同，免疫荧光共定位反映蛋白位置共存，而免疫共沉淀反映的是两蛋白有无相互结合，二者所针对问题不同，但均不能进行准确的半定量分析。从本研究中蛋白定量检测线粒体分裂程度的结果看，针刺干预能够降低线粒体分裂程度，尤其在12 h、24 h 的峰值量更为明显，在72 h 已接近正常状态，并且分裂程度已经显著低于单纯运动组，二者共同说明针刺能够改善离心运动所致的线粒体分裂现象，有利于线粒体结构恢复。

线粒体通过分裂和融合过程来实现质量控制，而大负荷离心运动后0 h～72 h 是骨骼肌结构和功能恢复的关键时间。作为重要的供能细胞器，线粒体在此期间也不断进行分裂、融合、自噬，甚至引起细胞凋亡。尚画雨[3]、于滢[2]、赵晓琴[4]等通过对大鼠进行一次性的大负荷运动，并进行针刺干预研究，发现大负荷运动会导致骨骼肌线粒体出现损伤，也会引起线粒体自噬，并导致细胞凋亡，而在运动后进行针刺干预能够明显缓解以上情况。许多研究均指出，线粒体损伤会引起线粒体分裂，而线粒体分裂是导致线粒体自噬和细胞凋亡的重要原因[5，6]。本研究透射电镜、免疫荧光共定位、免疫共沉淀、DRP1蛋白表达结果均显示，运动及针刺后0 h～48 h线粒体均发生明显分裂，形成了不同大小的线粒体片段；在峰值变化点上，12 h、24 h 等时相更是变化的关键时相点。综合本研究的结果以及以往研究，可见：大负荷离心运动后骨骼肌线粒体出现损伤，之后线粒体发生分裂，并通过线粒体自噬清除分裂下的损伤线粒体；对于损伤较为严重的线粒体，通过分裂直接导致细胞凋亡发生；而在离心运动后对骨骼肌进行针刺干预，在一定程度上可降低线粒体损伤，缓解线粒体分裂程度，最终降低线粒体的过度自噬和细胞凋亡，促进线粒体形态、功能以及骨骼肌机能的恢复。在离心运动及针刺干预后的整个过程中，骨骼肌线粒体并不是静止不变的，而是处在高度活跃中，结合以往研究可见，大负荷离心运动后线粒体损伤最严重的时相点出现在12～24 h[2，3]，而此时间段也是骨骼肌清除碎片的关键时间点，需要线粒体将受损部位分裂下来用于后续修复，因此离心运动后及针刺干预下线粒体分裂的峰值也同样出现在12～24 h时间段。

需要指出的是，由于离心运动及针刺干预后线粒体的动态变化较为明显，进行前后多时间点的连续研究显得尤为重要，建议后续进行线粒体分裂方面的相关研究时，若只能取单一时间点时，最好选在运动后12 h，可能会更为准确。本研究还存在一定不足，线粒体分裂-融合是其动力学的重要过程，线粒体的融合与线粒体功能恢复密不可分，因此检测线粒体的融合现象也是非常重要的，本课题组将进行相关后续研究。