基于MALDI质谱成像技术分析莲子中代谢物的组织分布

孙成龙，刘 伟，郭兰萍，王 晓*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院) 药学院，山东 济南 250014；2.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省 分析测试中心，山东省大型精密分析仪器应用技术重点实验室，山东 济南 250014； 3.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700)

莲子为睡莲科(Nymphaeaceae)植物莲NelumbonuciferaGaertn.的成熟种子，性平，味甘，有补脾止泻、益肾固精、养心安神的功效，主要用于脾虚久泻、遗精带下、心悸失眠[1]。目前，已被列入国家卫计委公布的药食两用中药名单和可用于保健食品的中药名单。莲子心为莲子中间的幼叶及胚根，性寒、味苦，有清心安神、交通心肾、涩精止血的功效，用于治疗热入心包、神昏谵语、心肾不交、失眠遗精和血热吐血[1-2]。开展对莲子及莲子心化学成分的研究，对于阐明其药效学机制具有重要的科学意义。

近年来，国内外学者采用多种现代分析技术对莲子及莲子心的化合物进行了深入表征。除了药理作用显著的生物碱类和黄酮类化合物外，莲子及莲子心还含有氨基酸、脂肪酸、糖苷、蛋白质等多类化合物[3-5]。目前，液相色谱-质谱联用技术因灵敏度高、特异性好、检测动态范围宽等优势，已成为药用植物中化学成分分析最常用的工具。然而，该技术的代谢物提取、纯化和富集等前处理过程严重破坏了代谢物在组织中的空间分布信息，无法实现代谢物的原位分析。

基质辅助激光解吸附质谱成像(Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging，MALDI-MSI)作为一种新型的分子影像技术，能够直接从组织表面获得大量已知或未知化合物的含量和空间分布信息[6-11]。目前，MALDI及其相关质谱成像技术已被成功用于以下方面：①可视化表征植物中代谢物的空间分布特征[12-14]；②探索植物应对生物和非生物胁迫的代谢机制[15-16]；③揭示植物次生代谢物生成、转运、贮藏的时-空代谢规律[17-18]。本研究通过优化MALDI基质，建立了一种可对莲子中化合物进行高覆盖可视化分析的质谱成像方法，实现了莲子中生物碱类、黄酮类、氨基酸类、脂肪酸类、有机酸类、胆碱类、磷脂类等多种化合物的组织原位可视化表征。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Rapiflex MALDI-TOF/TOF型质谱成像仪(德国Bruker公司，配flexAnalysis数据处理工作站)，HTX TM-SprayerTM型基质喷涂仪(美国HTX科技公司)，氧化铟锡(ITO)导电载玻片(对角线电阻约40 Ω，德国Bruker公司)，真空干燥器(上海越磁电子科技有限公司)，Thermo CryoStar NX50 NOVPD切片机(美国热电公司)，SCiLS Lab 2018b质谱成像数据分析软件(德国GmbH公司)。

1,5-二羟基苯甲酸(DHB，纯度>99.0%)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA，纯度>99.0%)、9-氨基吖啶(9-AA，纯度>99.5%)购于美国Sigma公司，莲心碱(纯度>99.0%)购于上海源叶生物科技有限公司，棕榈酸(纯度≥97.5%)、苹果酸(纯度≥99.0%)购于北京百灵威科技有限公司，1,5-二氨基萘(1,5-DAN，纯度≥98.0%)、N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(NEDC，纯度≥98.0%)、精氨酸(纯度≥99.0%)购于上海阿拉丁试剂有限公司，乙腈(质谱纯，德国Merck公司)，OCT包埋剂(美国樱花SAKURA公司)。

1.2 样品制备

将新鲜莲子置于冷冻切片机内30 min(-25 ℃)，用OCT包埋剂将冰冻好的莲子固定于切片机样品托上，制作厚度为20 μm的莲子冰冻组织切片(切片包括莲子胚芽、胚轴、胚根、子叶及种皮部分)。将制作好的组织切片转移到ITO导电载玻片上，在自制的真空干燥器中抽真空20 min备用。

1.3 基质喷涂

精密称量1,5-DAN 基质25 mg，置于10 mL容量瓶中，加入10 mL乙腈-水(50∶50，体积比)溶液，超声5 min备用。将真空抽干的莲子组织切片固定于基质喷涂仪中，进行基质喷涂。喷涂程序设置：基质溶液流速为0.075 mL/min，喷嘴温度为60 ℃，喷嘴移动速度为800 mm/min，喷嘴移动行间距为3 mm，喷嘴与样品间距为3 cm，喷涂循环次数为8次，1,5-DAN基质在组织切片上的喷涂密度约为0.73 μg/mm2。喷涂完毕的组织切片准备进行MALDI质谱成像分析。

1.4 MALDI质谱成像分析

将喷涂基质的组织切片置于Bruker Rapiflex MALDI-TOF/TOF型质谱仪中进行质谱成像分析。该仪器配备smartbeamTM3D激光，使用波长为355 nm，采样频率为5 000 Hz，激光能量设置为65%。MALDI质谱成像分别在正离子和负离子检测模式下进行，检测的质荷比(m/z)范围为80～1 000，样品扫描的空间分辨率为100 μm。MALDI质谱数据先用Data Analysis 4.0 软件进行初步预处理，进一步采用SCiLS Lab 2018b软件进行质谱成像图构建。

2 结果与讨论

2.1 MALDI基质的选择

进行MALDI质谱分析时，不同基质对待测物的解吸效率有显著差异，基质自身的质谱信号也可能干扰待测物的分析。因此，基质的选择对分析物的离子化起着至关重要的作用。前期研究表明[3-5]，莲子及莲子心中含有生物碱类、黄酮类、脂肪酸类、氨基酸类、磷脂类等多种化合物，复杂的化合物组分对于MALDI基质的选择提出了挑战。生物碱类、磷脂类等化合物易在正离子模式下检出，而黄酮类、脂肪酸类化合物则更适合负离子模式检测。本研究以莲心碱、精氨酸、棕榈酸、苹果酸为代表性代谢物进行MALDI基质优化，配制固定浓度的4种对照品溶液，将对照品溶液与不同基质溶液按照1∶1的体积比混合均匀，然后滴加到样品靶板上。干燥后进行MALDI-MS分析，提取对照品的离子强度进行比较。在正离子检测模式下，对3种常用基质(DHB、CHCA、1,5-DAN)进行了比较，结果表明以1,5-DAN为基质时分析物的相对峰强度更高(图1A)。在负离子检测模式下，对3种常用基质(9-AA、NEDC、1,5-DAN)进行了比较，结果同样表明以1,5-DAN为基质时分析物的相对峰强度更高(图1B)。因此本研究在正、负离子检测模式下均选择1,5-DAN作为莲子MALDI质谱成像的基质。

2.2 不同种类代谢物在莲子中的组织分布特征

2.2.1 生物碱类化合物的分布特征莲子中化学成分的研究集中于生物碱类化合物，主要包括：以莲心碱(Liensinine)和异莲心碱(Isoliensinine)为代表的双苄基异喹啉类生物碱；以衡州乌药碱(Coclaurine)和去甲基衡州乌药碱(Norcoclaurine)为代表的单苄基异喹啉类生物碱；以北美鹅掌楸尼定碱(Lirinidine)和荷叶碱(Nuciferine)为代表的阿朴啡类生物碱。作为莲子及莲子心的主要药效成分，生物碱类化学物具有显著的抗心律不齐、降血压和抗癌作用。生物碱是一类含氮的碱性有机化合物，通常在正离子检测模式下进行质谱分析。在优化条件下，将制作好的莲子组织切片喷涂基质后进行MALDI质谱成像分析。在SCiLS Lab 2018b软件中靶向提取生物碱类化合物的[M+H]+离子峰进行质谱成像图构建，其中代表性生物碱类化合物的质谱成像图如图2所示。结果表明，双苄基异喹啉类生物碱：莲心碱和异莲心碱([M+H]+，m/z611.3)几乎只分布于莲子胚芽中(图2B)；去甲基莲心碱(Norisoliensinine，[M+H]+，m/z597.3)同样主要分布于莲子胚芽中，但在莲子子叶中也有少量分布(图2C)。单苄基异喹啉类生物碱：衡州乌药碱([M+H]+，m/z286.1，图2D)和去甲基衡州乌药碱([M+H]+，m/z272.1，图2E)主要分布在莲子胚芽中，在莲子子叶中也有一定的分布。之前的研究显示，阿朴啡类生物碱主要集中在荷叶中，在莲子中的含量较低[1]；本研究结果表明，阿朴啡类生物碱：包括北美鹅掌楸尼定碱([M+H]+，m/z282.1，图2F)和荷叶碱([M+H]+，m/z296.2，图2G)在莲子胚芽、胚轴和子叶中均有分布。

图2 莲子中代表性生物碱类化合物的质谱成像图Fig.2 MS images of representative alkaloids in lotus seed

2.2.2 黄酮类化合物的分布特征黄酮类化合物是莲子中另一类重要的药效成分，其具有很强的抗氧化、抗肿瘤活性。文献报道显示，黄酮类化合物更适合在负离子检测模式下进行质谱分析[17]。本实验制作了莲子的相邻组织切片，在负离子检测模式下进行MALDI质谱成像分析，其中代表性黄酮类化合物的质谱成像结果如图3A所示。非常值得关注的是，黄酮类化合物如山萘酚3-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-glucoside，[M-H]-，m/z447.1)和槲皮素3-O-半乳糖苷(Quercetin 3-O-galactoside，[M-H]-，m/z463.1)等除了在莲子胚芽中的含量较高外，还特异地分布在莲子种皮中。由此推测，莲子中黄酮类化合物主要在莲子胚芽和种皮中合成和贮藏。

图3 莲子中代表性黄酮类(A)、氨基酸类(B)、脂肪酸类(C)、有机酸类(D)、胆碱类(E)、 磷脂类(F)化合物的质谱成像图Fig.3 MS images of representative flavonoids(A)，amino acids(B)，fatty acids(C)，organic acids(D)，cholines(E) and phospholipids(F) in lotus seed

2.2.3 氨基酸类化合物的分布特征氨基酸是植物中一类重要的初生代谢物，在植物生物和非生物胁迫反应调控、细胞信号转导、植物能量代谢、植物次生代谢物合成等过程中发挥着极其重要的作用。碱性氨基酸侧链常含有碱性化学基团，更适合在正离子检测模式下进行MALDI质谱成像分析；而酸性氨基酸侧链常含有酸性化学基团，更适合在负离子检测模式下进行MALDI质谱成像分析。精氨酸除了作为一种重要的氮素贮藏营养物质供植物再利用外，还是植物合成NO和多胺等信使分子的前体物质。本研究表明，莲子中精氨酸(Arginine，[M+H]+，m/z175.1)主要分布在莲子子叶的顶部，在莲子胚轴和胚根部位也有较高的分布(图3B1)。植物中至少有25%的光合产物储存在由苯丙氨酸衍化而来的苯丙烷类化合物中。另外，从碳流的角度来看，苯丙氨酸代谢通路是植物次生代谢网络最重要的通路之一。本研究中，MALDI质谱成像数据显示莲子中苯丙氨酸(Phenylalanine，[M-H]-，m/z164.1)主要分布在莲子子叶的顶部及外周部，在莲子胚中的分布较少(图3B2)。综上，推测莲子子叶的顶部和外周部位是莲子储存能量、应对生物和非生物胁迫、合成次生代谢物的主要部位。

2.2.4 脂肪酸类化合物的分布特征脂肪酸作为细胞基本成分之一，具有重要的生理作用。它们既参与细胞膜的构成，又可为细胞活动提供能量，同时还是一些信号分子的前体物质。在负离子检测模式下，对莲子切片进行MALDI质谱成像分析。靶向提取代表性脂肪酸的质谱成像图，发现尽管脂肪酸类化合物在莲子中的含量非常丰富，但在莲子种皮、胚芽、胚轴、胚根及子叶等不同组织部位的分布差异不明显。代表性脂肪酸类化合物棕榈酸(Palmitic acid，[M-H]-，m/z255.2，图3C1)和亚油酸(Linoleic acid，[M-H]-，m/z279.2，图3C2)在莲子中的组织分布见图3C，可见其除了在莲子子叶底部分布稍多之外，在其它组织区域中无明显的分布差异。

2.2.5 有机酸类化合物的分布特征小分子有机酸是植物中另一类重要的酸性代谢物，它们在植物能量代谢、植物应对生物和非生物胁迫反应等过程中发挥着重要作用。例如，苹果酸广泛参与植物的光合作用和呼吸作用；咖啡酸是一种常见的植物酚酸，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、保肝等生物活性。代表性有机酸类化合物的质谱成像结果如图3D所示，结果表明苹果酸(Malic acid，[M-H]-，m/z133.0)在莲子子叶底部的含量最高，在莲子子叶中间部位的含量稍低，在莲子子叶顶部的含量最低(图3D1)。咖啡酸(Caffeic acid，[M-H]-，m/z179.0)主要分布在莲子子叶的四周(图3D2)。

2.2.6 胆碱类化合物的分布特征胆碱除了是植物甘油磷脂酰胆碱(卵磷脂)合成的重要前体物质外，还可提高植物中可溶性糖及游离氨基酸的含量。由于结构中含有季铵基团，胆碱类化合物非常适合在正离子检测模式下进行MALDI质谱成像分析。从代谢通路上，胆碱是甘油磷酸胆碱的代谢产物，在甘油磷酸二酯酶磷酸结构域6(GDPD6)的催化下，甘油磷酸胆碱可代谢为胆碱、磷酸和甘油。代表性胆碱类化合物的质谱成像结果如图3E所示，结果表明胆碱(Choline，[M]+，m/z104.1)主要分布在莲子胚芽和子叶的底部(图3E1)。与之相反，甘油磷酸胆碱(Glycerophosphocholine，[M+H]+，m/z258.1)则更多地分布在莲子子叶的顶部(图3E2)。

2.2.7 磷脂类化合物的分布特征磷脂是细胞生物膜系统的主要组成成分，此外还在植物细胞能量供应、信号转导等生命活动中发挥着重要作用。其中，甘油磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)结构中含有季铵基团，更适合在正离子检测模式下进行MALDI质谱成像分析；而甘油磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)更适合在负离子检测模式下进行MALDI质谱成像分析。本研究制作了相邻的莲子组织切片，分别在正、负离子检测模式下进行质谱成像分析。代表性磷脂分子的质谱成像结果如图3F所示，甘油磷脂酰胆碱-C38∶5(PC-38∶5，[M+Na]+，m/z846.5)在莲子子叶中的含量远高于莲子胚(图3F1)；甘油磷脂酰乙醇胺-C36∶2(PE-36∶2，[M-H]-，m/z742.5，图3F2)在莲子子叶中的含量远高于莲子胚。

3 结 论

通过优化基质，本文建立了一种高覆盖的MALDI质谱成像方法，实现了莲子中生物碱类、黄酮类、氨基酸类、脂肪酸类、胆碱类、有机酸类、磷脂类等多种化合物的组织原位可视化表征。不同化合物在莲子中的分布特征有较大差异，其中：生物碱类化合物集中分布在莲子胚芽中；黄酮类化合物在莲子胚芽和种皮中的含量较高；氨基酸类化合物在莲子子叶中的含量显著高于莲子胚；脂肪酸类化合物在莲子不同组织区域中的含量分布差异很小；胆碱类化合物在莲子胚芽和莲子子叶底部的含量更高，甘油磷酸胆碱在莲子子叶顶部的含量更高；有机酸类代谢物和绝大多数磷脂类化合物在莲子子叶中的含量高于莲子胚。本研究首次可视化地表征了不同化合物在莲子不同组织区域的空间分布特征，为研究莲子及莲子心药物质量、探究莲子中化合物的时-空代谢网络、揭示莲子应对生物和非生物胁迫的代谢机制提供了新的技术支持。