近红外光谱法快速测定附子中6个生物碱的含量

戴胜云,马青青,蒋双慧,刘 杰,过立农, 乔 菲,周 娟,乔延江,郑 健*,马双成*

(1.中国食品药品检定研究院,北京 100050；2.青海省药品检验检测院,青海 西宁 810016；3.中国药科大学 中药学院,江苏 南京 210009；4.四川省食品药品检验检测院,四川 成都 611730； 5.北京中医药大学 中药信息学系,北京 102400)

附子(AconitiLateralisRadixPraeparata)为毛茛科乌头属植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.子根的加工品,是《中国药典》2015年版一部的收载品种[1],属于常用大宗中药材,始载于《神农本草经》,列为下品,具有回阳救逆、补火助阳的功效,有“回阳救逆第一品”之称[2]。附子的道地性比较显著,道地产区主要为四川,尤其是江油等地,另外湖北和湖南等地也有产出。附子饮片包括黑顺片、白附片、炮附片和淡附片,黑顺片和白附片是市场上的常见中药饮片,为常用有毒中药[1]。研究表明,附子中的新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱等生物碱类成分,既是有效成分,也是毒性成分,均具有镇痛和抗炎等作用,其中的3个双酯型生物碱——新乌头碱、次乌头碱和乌头碱为剧毒性成分。附子经炮制后,其剧毒的双酯型生物碱降解为毒性较轻的单酯型生物碱[3]。《中国药典》(2015年版)现行标准规定附子中单酯型生物碱(包括苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱)的总量不得少于0.01%；双酯型生物碱(新乌头碱、次乌头碱和乌头碱)的总量不得过0.02%[1]。

现有文献对附子中的化学成分含量进行测定时,一般采用高效液相色谱与QDA质谱联用、等离子体质谱法、高效液相色谱法和超高效液相色谱法[4-7]。这些方法均需对样品进行前处理,耗时较长,一般需在实验室进行检测工作。而近红外光谱因具有快速、无损、无需样品前处理等优点广泛用于中药各个领域,如中药原料药、中药辅料、中药制剂的质量分析[8-10],以及中药制药过程的在线监测与控制研究[11-13]、中药产品实时放行策略[14-15]等,是中药质量快速分析的一种新方法。

为进一步了解市场上附子饮片的质量现状,中国食品药品检定研究院民族药室于2019年中药饮片专项抽验中选择附子开展专项抽验工作,共抽样199批,检验其【性状】和【薄层色谱】项,合格率为100%。由于上述6种双酯型或单酯型生物碱在含量测定时,前处理和色谱条件较复杂,耗时且检测成本较高,故本研究从抽检样品中选择部分样品,采集近红外光谱数据,对比偏最小二乘(PLS)和最小二乘支持向量机(LS-SVM)定量校正模型,预测附子中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、乌头碱、次乌头碱和新乌头碱6个成分以及双酯型生物碱总量和单酯型生物碱总量,判断附子的【检查】项和【含量测定】项是否合格,以期为实现快速无损的附子质量控制提供帮助。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

GSA近红外光谱仪(山东金璋隆祥智能科技有限责任公司)；UltiMate3000型高效液相色谱仪(紫外检测器)(赛默飞世尔公司),Waters XBridge®C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱；万分之一、十万分之一电子天平(赛多利斯公司);KQ-300DA型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

苯甲酰新乌头原碱(批号111785-201805,纯度93.1%)；苯甲酰乌头原碱(批号111794-201705,纯度99.1%)；苯甲酰次乌头原碱(批号111796-201705,纯度98.6%)；新乌头碱(批号110799-201608,纯度98.5%)；次乌头碱(批号110798-201609,纯度99.2% )；乌头碱(批号110720-201312,纯度98.7%)均来自中国食品药品检定研究院。乙腈、异丙醇均为色谱纯,浓氨溶液、乙酸乙酯、冰醋酸、三乙胺均为分析纯,水为Milli-Q纯化水。

白附片、黑顺片、炮附片药材均为2019年度国家药品抽验计划抽验样品,自行收集样品为本课题组赴四川江油调研期间收集。所有样品经中国食品药品检定研究院中药所民族药室鉴定为合格药材。样品粉碎后过3号筛,备用。样品信息见表1。

表1 样品信息表Table 1 Sample information

1.2 供试品溶液的制备

取本品粉末约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加氨试液3 mL,精密加入异丙醇-乙酸乙酯(体积比,1∶1，下同)混合溶液50 mL,称定重量,超声处理(功率300 W,频率40 kHz,水温25 ℃以下)30 min,放冷,再称定重量,用异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25 mL,40 ℃以下减压回收溶剂至干,残渣精密加入乙腈-水(体积比，21∶79,下同)混合溶液3 mL溶解,用0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

1.3 混合对照品溶液的制备

分别取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱对照品适量,精密称定,用乙腈-0.2%冰醋酸溶液(21∶79)溶解并定容,制成每1 mL含苯甲酰新乌头原碱453.2 μg、苯甲酰乌头原碱549.4 μg、苯甲酰次乌头原碱545.8 μg、新乌头碱100.2 μg、次乌头碱110.9 μg、乌头碱113.0 μg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液1 mL至10 mL容量瓶中,加乙腈-0.2%冰醋酸溶液(21∶79)配制成上述6个成分别约50、50、50、10、10、10 μg·mL-1的混合溶液,即得。

1.4 实验条件

1.4.1 液相色谱条件色谱柱：Waters XBridge®C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；乙腈(A)-0.2%冰醋酸溶液(三乙胺调pH值至6.20)(B)为流动相,梯度洗脱：0～30 min,21%～29%A；30～51 min,29%～35%A；51～56 min,35%A；流速1.0 mL·min-1,检测波长235 nm,柱温30 ℃,进样量10 μL。

1.4.2 近红外光谱条件使用近红外光谱仪采集样品的近红外光谱。取已过3号筛的附子饮片粉末适量(尽量保证不同样品的取样量一致),混合均匀后倒入样品杯,压实。以内置背景为参比,采用漫反射的方式采集样品光谱图,扫描范围1 550～1 950 nm,扫描次数32,分辨率16 cm-1,温度(25±2)℃,相对湿度(55±2)%。每份样品重复测定3次(每次测定结束后将样品重新倒回自封袋,混合均匀后进行下一次测定),取平均光谱用于后续数据处理及建模以减少误差。

2 结果与讨论

2.1 附子HPLC方法学考察结果

经方法学考察,得到苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的线性范围分别为9.0～453.2、10.9～549.4、10.9～545.8、2.0～100.2、2.2～110.9、2.2～113.0 μg·mL-1,相关系数均为0.999 9,表明各化合物在相应范围内线性关系良好。6种生物碱的精密度、重复性和稳定性(48 h)均符合要求。

当信噪比为3时,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的检出限分别为0.27、0.36、0.37、0.23、0.26、0.36 μg·mL-1；当信噪比为10时,其对应的定量下限分别为1.04、1.16、1.23、1.18、1.26、2.05 μg·mL-1。

取已知含量黑顺片样品粉末6份(13号样品),每份约1 g,置于具塞锥形瓶中,分别精密加入对照品溶液(苯甲酰新乌头原碱3.606 7 μg·mL-1、苯甲酰乌头原碱0.477 7 μg·mL-1、苯甲酰次乌头原碱0.489 8 μg·mL-1、新乌头碱1.410 5 μg·mL-1、次乌头碱1.267 7 μg·mL-1、乌头碱0.239 8 μg·mL-1) 50 mL,按照“1.2”方法制备供试品溶液,按“1.4.1”色谱方法测定,计算回收率,得上述6个成分的回收率依次为99.9%、95.2%、97.6%、104%、101%、86.8%,表明各化合物回收率良好。

2.2 样品测定

取各附子样品,按“1.2”方法制备供试品溶液,按照“1.4.1”色谱条件进行试验,测定峰面积,用外标一点法计算样品中各成分的含量,并以此含量作为参考值,建立参考值与NIR光谱数据之间的定量校正模型。

图1 附子的近红外光谱图Fig.1 NIR spectrogram of Aconiti Lateralis Radix Praeparata

2.3 NIR定量校正模型的建立

38批附子样品的NIRS光谱见图1。采用PLS和LS-SVM分别建立上述6种生物碱及单酯型生物碱总量和双酯型生物碱总量校正模型的近红外定量校正模型。数据处理均在Unscramber数据分析软件(version 9.6,CAMO软件公司)和MATLAB(version 7.0,Math works公司)软件上完成。数据处理工具包分别为PLS toolbox和LS-SVM lab toolbox1.8。

采用化学计量学指示参数——相关系数(r)、校正均方根误差(RMSEC)、交叉验证均方根误差(RMSECV)、预测均方根误差(RMSEP)[16-17]和相对预测偏差(RPD)[18]进行模型评价。其中RPD值越大,所对应的校正模型的预测性能越好,当RPD大于3时,表明模型具有很好的预测性能；当RPD小于2.5时,表明模型预测性能差,不适于定量分析。在分析中,需综合考虑校正集、验证集和交叉验证的结果,且在校正集和验证集相关参数接近时建立最优化模型。

2.3.1 样本集的选择恰当地选取具有代表性的校正集将直接影响所建模型的准确性和实用性,是建模成功的前提。选择常用的K-S样本集划分方法,使校正集和验证集的样品比例数约为2∶1,其中26个样本作为校正集,剩余12个样本作为验证集,校正集与验证集的数据分布如表2所示。

表2 校正集与验证集的数据分布Table 2 The data distribution for calibration set and validation set (%)

2.3.2 不同光谱预处理方法的选择由于在NIR光谱的采集过程中,仪器状态、样品状态及测量条件的差异会造成NIR光谱的偏差或旋转,需采用适当的预处理方法予以矫正。本文分别采用多元散射校正(MSC)、标准正态变换(SNV)、正则化变换(Normalize)、基线校正(Baseline)、光谱变换(ST)、光谱去噪(WDS)、S-G平滑加1阶导数(SG-1st)和S-G平滑加2阶导数(SG-2nd)(平滑点包括9和11)等预处理方法进行处理。

2.3.3 偏最小二乘模型采用PLS建立定量模型时,最优潜变量因子数由留一交叉验证法(LOO)和预测误差平方和(PRESS)获得。模型性能采用RPD、RMSEC、RMSECV、RMSEP及其相应相关系数r(rcal和rpre)进行评价。相关系数越大,各类误差越小,RPD值越大,说明模型性能越好。由表3可知,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和单酯型生物碱总量分别在采用MSC(或SNV)、SNV、MSC和MSC预处理方法时所建的PLS模型优于其他方法；3种双酯型生物碱及其总量则在采用Baseline预处理方法时所建的PLS模型性能较好。分别采用其最优预处理方法对6个成分及单酯型和双酯型生物碱总量进行建模。如表3所示,单酯型生物碱及其总量和双酯型生物碱及其总量的RPD值均较小,最大值仅为3.8(双酯型生物碱总量),多数模型的RPD值小于3,说明PLS模型的性能不高,需进一步提高模型的可靠性。因PLS模型为线性关系,故考虑建立非线性的最小二乘支持向量机模型。

表3 采用不同预处理方法的PLS模型参数Table 3 The PLS model with different pre-processing methods

*original spectrum(Raw),multiplicative scatter correction(MSC),standard normal variate transformation(SNV),baseline,normalize,spectroscopic transformation(ST),wavelet denosing of spectra(WDS),Savitzky-Golay smoothing with 9 points(SG(9)) plus first-order derivatives(SG9-1st),SG(9) plus second-order derivatives(SG9-2nd),SG(11) plus first-order derivatives(SG11-1st),and SG(11) plus second-order derivatives(SG11-2nd)

2.3.4 最小二乘支持向量机模型支持向量机是由Vapnik在统计学习理论的基础上建立的一种非常有效的机器学习方法[19],最初用于模式识别,目前在信号处理、系统辨识与建模、先进控制和软测量等领域均得到了广泛应用。最小二乘支持向量机(LS-SVM)作为支持向量机(SVM)的一种类型[19],已越来越广泛地运用于各个学科领域。Chauchard等[20]研究指出,LS-SVM模型考虑了自变量和因变量之间的非线性关系。

采用LS-SVM建立定量模型时,评价参数为RPD、偏差(BIAS)、RMSEP及其相应决定系数r(rcal和rpre)。在基于LS-SVM建立定量模型时需要对两个超参数gam和sig2通过交叉验证进行优化。gam是正则化参数,用于确定训练误差最小化和预测函数平滑度的平衡；sig2是高斯径向基(Gaussian radial basis function)核函数参数。

表4为不同预处理方法下LS-SVM的建模结果。可以看出,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、单酯型生物碱总量和双酯型生物碱总量的最佳预处理方法分别为SNV、MSC、SG9-1st、WDS、SG9-1st、SNV(或MSC)和Baseline,其中乌头碱不经过光谱预处理也能建立很好的模型,故采用原始光谱建立乌头碱的LS-SVM模型。

表4 不同预处理方法的LS-SVM模型参数Table 4 The LS-SVM model with different pre-processing methods

将原始光谱进行最佳光谱预处理后,建立LS-SVM校正模型。LS-SVM的两个超参数通过交叉验证进行优化,模型参数如表4所示。其中,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、单酯型生物碱总量和双酯型生物碱总量所建模型的RPD分别为3.3、3.2、4.1、7.7、8.8、7.6、4.0和8.6。相较于PLS模型,RPD得到显著提升。如图2所示,6种生物碱及单酯型生物碱总量和双酯型生物碱总量定量校正模型的相关系数均在0.9以上,RMSEC和RMSEP均在0.1以下,说明NIR模型预测值和HPLC测定值有较好的线性关系,模型拟合能力良好。苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、单酯型生物碱总量和双酯型生物碱总量所建模型的实测值与预测值之间的偏差分别为0.003 3、0.000 6、0.001 9、0.001 5、0.002 4、0.000 6、0.004 8和0.004 3。表明应用近红外光谱结合LS-SVM建模方法可以准确快速地进行附子中单酯型生物碱和双酯型生物碱的含量预测,对于附子的质量控制有一定的指导意义。

2.3.5 PLS与LS-SVM建模结果的比较以附子中的3个单酯型生物碱及其总量和3个双酯型生物碱及其总量共计8个数值为研究对象,对比了LS-SVM模型和PLS模型的建模效果,结果如表5所示。由表可知,对于上述8个数值,LS-SVM模型的预测均方根误差(RMSEP)均得到不同程度的下降；验证集相关系数rpre和RPD则得到不同程度的提升。对于建模预测结果而言,验证集的相关系数越大,越接近1,预测均方根误差越小,相对预测偏差越大,表明模型预测性能越好。由对比结果可知,LS-SVM的预测性能相比PLS模型均有不同程度的提高,这是由于LS-SVM模型考虑了自变量和因变量之间的非线性关系,改善了其预测性能。而本次实验的对象是附子粉碎后的样品,样品的粒径大小可能会对建模结果有影响,而建模结果的提高则表明NIR光谱与粒径之间可能存在着一些非线性关系。

图2 附子中6个生物碱及其总量实测值与预测值的相关图Fig.2 Correlation between measured value and predicted value for the 6 components in Aconiti Lateralis Radix Praeparata A-H:benzoylmesaconine;benzoylaconine;benzoylhypaconine;meaconitine;hypaconitine;aconitin;the total of monoester-type alkaloids;the total of diester-type alkaloid

表5 PLS模型和LS-SVM模型建模预测结果比较Table 5 The comparison of the prediction results between PLS and LS-SVM

3 结 论

本文以附子为研究对象,对其中的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、单酯型生物碱总量和双酯型生物碱总量进行了近红外光谱快速测定，并比较了PLS和LS-SVM两种建模方法的性能。结果表明，LS-SVM性能显著优于PLS,说明附子中生物碱的量与NIR光谱预测值之间存在非线性关系。通过本研究建立的方法,基于近红外光谱结合LS-SVM建模可以快速预测双酯型生物碱总量和单酯型生物碱总量,方法操作简单,无需样品预处理,实现了快速、绿色分析的目的,也为更好控制附子药材质量提供了帮助。