丹荷颗粒治疗高脂血症质量标志物发现研究

2021-01-29马兆臣陈奎奎潘琦雪闫晓宁苏汝彬朱美霞张银环肖红斌

分析测试学报 2021年1期

马兆臣，陈奎奎，潘琦雪，闫晓宁，刘洁，苏汝彬，朱美霞，张银环，阳娇，李乾，肖红斌,4*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.北京中医药大学中药分析与转化研究中心，北京 100029； 3.北京中医药大学中医药研究院，北京 100029；4.石河子大学药学院，新疆石河子 832002)

丹荷方来源于名老中医郭维琴临床经验方，由荷叶、丹参、山楂、虎杖、陈皮、薏苡仁6味药组成，功效为活血消食、祛湿健脾，临床用于治疗痰瘀互阻型高脂血症，能够显著降低高脂血症金黄地鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三油酸酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，并显著升高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平[1]。该方目前处于中药新药临床前药学研究阶段，且已成功制成丹荷颗粒(Danhe granules,DHG)剂，但缺乏相应的质量控制标准。质量控制的根本目的是对中药有效性的控制，而刘昌孝院士所提出的中药质量标志物概念[2]，将药效相关性作为质量标志物确定的重要原则并严格控制，已成为规范中药质量、提高中药及其制剂质量一致性的可行方法。

DHG作为尚在研发的中药新药，有效成分特征及含量稳定对其至关重要，由此确定DHG质量标志物筛选的四要素为降脂药效、成分特征、含量可测及稳定存在。目前，中药药效相关质量标志物研究方法的核心在于建立活性成分与药效、作用机制的关联[3-6]。其中网络药理学方法通过对复杂多层次相互作用的各种网络的分析[7]，可直观地表明成分与作用机制间的关系，有助于快速发现中药潜在有效性质量标志物[8-9]。本研究基于网络药理学方法，通过对成分靶点及疾病基因共有靶点的生物过程、通路富集及网络拓扑分析，确定DHG降脂关键靶点及相应作用成分；而后建立了油酸(OA)诱导的HepG2脂质堆积细胞模型对成分活性进行验证；最后综合活性成分在制剂中的含量、稳定性、特征性，确定DHG治疗高脂血症的质量标志物，以期为后续DHG质量标准的建立提供合理的候选质控指标。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

人肝癌细胞系(HepG2)购自中国科学院(上海)；DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶(含乙二胺四乙酸，EDTA)、0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐(PBS)、胎牛血清(FBS)均来源于Hylcone(Thermo scientific，美国)；青霉素-链霉素(Amresco，美国)；6孔细胞培养板(Costar，美国)；Eppendorf管(Axygen，美国)；油酸、二甲基亚砜(DMSO)、油红O染液、4%多聚甲醛固定液(Sigma，美国)；异丙醇(LC-MS级，Fisher，美国)；甘油三酯(TG)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Bradford试剂盒、细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司)；白藜芦醇(批号B-002-170426)、柚皮素(批号Y-034-181217)(纯度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)。

生物安全柜(HFease1800，上海力康医疗设备有限公司)；3111 CO2培养箱(Thermo，美国)；超净台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；细胞培养板(Corning，美国)；IX71倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；3-18KS高速冷冻离心机(Sigma，德国)；Infinite 200 Pro Nanoquant连续波长多功能酶标仪(Tecan,瑞士)。

1.2 溶液配制

柚皮素、白藜芦醇用DMSO超声溶解，配成10 mmol/L的母液，转移至生物安全柜中加基础培养基稀释为10 μmol/L的给药溶液(含0.1% DMSO)，过0.22 μm微孔滤膜，待用。取0.056 g氢氧化钾、10 mL PBS、0.1 g BSA，涡旋混匀后加入31.6 μL油酸，得10 mmol/L油酸溶液，过0.22 μm滤膜后于-20 ℃保存，使用时用基础培养基稀释成200 μmol/L的油酸造模液，按照油红O∶PBS=3∶2混合，过0.22 μm微孔滤膜后即制成油红O染色液，在2 h内使用。

1.3 实验方法及数据处理

1.3.1 DHG体内成分收集课题组前期对给药后SD大鼠血浆、尿液及粪便中成分进行分析，共鉴定出36个原型成分，可能是DHG治疗高脂血症潜在活性成分，并将其用于后续网络药理学的研究。

1.3.2 成分靶点及疾病基因预测采用STITCH数据库(http://stitch.embl.de/)和Swiss target prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)对DHG中成分的作用靶点进行预测，从STITCH “chemical aliases”文件和“protein chemical links detailed”文件中收集化合物同名成分及相关靶点，保留与成分结合得分≥700的靶点；从Swiss target prediction收集概率值≥0.5的靶点；而后将得到的所有靶点导入UniProt数据库，提取其Gene Name和Gene ID。本研究以“Hyperlipidaemia”即高脂血症为主题词，基于TTD (http://bidd.nus.edu.sg/bi-dd.databases/ttd/ttd.asp)及Gen-eCards (https://www.genecards.org)数据库收集高脂血症疾病相关人源基因。为避免假阳性靶点，剔除TTD中基因类型为“Discontinued”以及GeneCards中相关得分<10的基因。

1.3.3 共有靶点生物功能与通路富集分析将丹荷颗粒成分作用靶点与高脂血症疾病基因比对，获得成分靶点与疾病基因共有靶点，再将共有靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/,Version 6.8)，Select identifier设置为uniprot_accession，限定物种为Homo Sapiens，阈值为P<0.05，对靶点进行GO生物过程分析和KEGG通路分析。

1.3.4 共有靶点交互作用分析“度”(Degree)是衡量网络节点重要性的最直接方法，度值越大的节点在网络中越重要。将共有靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)，物种选择Homo Sapiens，构建共有靶点交互作用网络，将网络中各节点的交互作用参数导入Cytoscape 3.7.0软件以绘制交互网络，并将节点(node)大小和颜色深浅与度值大小对应，边(Edge)的粗细与结合分数大小对应。通过关键节点分析插件Network Analyzer计算共有靶点在交互作用网络中的度值。

1.3.5 成分-共有靶点-疾病网络构建收集丹荷颗粒成分作用靶点与高脂血症疾病基因,导入Cytoscape 3.7.0构建成分-共有靶点-疾病网络。

1.3.6 HepG2细胞培养、造模及给药HepG2细胞培养于含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞生长至约80%时用0.25%胰蛋白酶将其消化并传代，取对数生长期细胞进行实验。将对数生长期细胞制成细胞悬液，以5×105个/mL接种于6孔板，每孔2 mL细胞悬液。将细胞分为空白对照组(Con)、模型组(OA)、白藜芦醇给药组(OA+Res)和柚皮素给药组(OA+Nar)，每组设置3个复孔，培养24 h后，空白对照组给予基础培养基，其余各组用含200 μmol/L油酸的基础培养基刺激细胞24 h，制成脂质堆积模型。而后空白对照组给予含0.1% DMSO的基础培养基，给药组弃去造模液，分别加入终浓度为10 μmol/L的含白藜芦醇、柚皮素基础培养基，继续培养24 h。

1.3.7 油红O染色及测定经含白藜芦醇、柚皮素基础培养基培养24 h后，所有组吸弃培养基，PBS洗3次，弃去；用0.4%的多聚甲醛室温固定20 min，弃去；每孔加入500 μL油红O染色液避光染色30 min，弃去；每孔加入1 mL 60%异丙醇溶液分化5 s，PBS洗2次，弃去；200×放大倍数镜检拍照；每孔加入500 μL异丙醇室温孵育10 min，用酶标仪测定其510 nm处吸光值。

1.3.8 TG含量测定细胞分组、给药及处理同“1.3.6”方法。给药24 h后用预冷PBS洗涤2次。每孔加入100 μL 2%Tritonx-100裂解液，冰上裂解30 min，裂解好的液体不离心直接测定。参照甘油三酯(TG)测定试剂盒说明书检测细胞内TG含量，计算公式为TG含量(mmol/gprot)=(样本OD值-空白OD值)/(校准OD值-空白OD值)×校准品浓度(2.26 mmol/L) ÷待测样本蛋白浓度(gprot/L)。

2 结果与讨论

2.1 DHG体内成分收集

本研究最初通过TCMSP等中药成分数据库获取DHG成分，并通过药代动力学参数中的口服生物利用度(OB)确定DHG口服生物利用度较好的成分(OB≥30%)，但发现DHG部分重要降脂活性成分如丹酚酸B[10]、橙皮苷[11]、虎杖苷[12]等的OB分别为3.01%、13.33%、21.44%，生物利用度较差，与本课题组对DHG体内成分鉴定结果不一致。药物代谢研究认为中药活性成分可能为原型成分或其代谢产物[13]，故基于丹荷颗粒真实存在于体内的成分进行网络药理学分析，以缩小潜在活性成分的范围。为避免遗漏重要活性成分，采用DHG给药后血浆、尿液及粪便中原型成分作为网络药理学研究的成分来源，结果见表1。

表1 DHG成分库Table 1 Component library of DHG

表2 DHG降脂作用靶点Table 2 Lipid-lowering targets of DHG

2.2 共有靶点

基于Swiss target prediction和STITCH数据库，分别得到264和179个成分作用靶点，删除重复项，得到DHG成分作用靶点268个。基于TTD及GeneCards数据库，分别得到高脂血症疾病基因23及57个。通过比对分析丹荷颗粒成分靶点以及高脂血症疾病基因，得到10个共有靶点，这些共有靶点可能是DHG降脂的作用靶点(见表2)。

2.3 共有靶点生物过程与通路富集分析

共有靶点生物过程分析结果(P<0.01)见图1，较为显著的生物过程包括脂质代谢过程、类固醇激素介导的信号通路过程以及脂蛋白分解代谢过程，其中LDLR、PPARA、PPARG靶点参与的脂质代谢过程可能是DHG治疗高脂血症最重要的生物过程，其他生物过程包括受体生物合成过程的负调控、甘油三酯隔离的负调节、胆固醇储存负调节、脂肪酸氧化的正调控、低密度脂蛋白颗粒清除率等。共有靶点通路富集结果(P<0.05)见图2，PPARA、PPARG参与的PPAR信号通路以及LDLR、ADORA1、ADORA2A参与的cAMP信号通路是最显著的代谢通路，可能是DHG降脂作用最重要的代谢通路，其他通路包括脂肪细胞脂解的调控、卵巢类固醇生成、催乳素信号通路等。

图1 DHG成分生物过程分析Fig.1 Biological process analysis of components in DHG

2.4 共有靶点交互作用分析

共有靶点交互作用网络见图3，该网络由10个节点和31条边组成。在共有靶点交互作用网络中，ESR1、PPARG、PPARA、LDLR、APOB是度值(分别为9、8、7、7、7)最大的5个节点，是网络中的重要靶点。

图2 DHG成分通路富集分析Fig.2 Pathway enrichment analysis of components in DHG

图3 共有靶点蛋白互作网络Fig.3 Protein interaction network with common targets

图4 DHG成分-共有靶点-疾病网络Fig.4 DHG components-common targets-disease network

2.5 关键靶点分析

基于中药多靶点、多途径的作用特点，关键靶点的确定需根据靶点交互作用及共有靶点生物过程、通路富集结果综合确定。故本研究进一步结合重要通路即PPAR、cAMP通路参与靶点(PPARA、PPARG、LDLR、ADORA1、ADORA2A)以及重要代谢过程即脂质代谢过程的参与靶点(LDLR、PPARA、PPARG)，发现PPARG、PPARA、LDLR可能是DHG降脂作用的关键靶点，在DHG降脂过程中发挥着重要作用。此外，本课题组体内实验研究也发现DHG治疗高脂血症金黄地鼠模型作用机制与上调LDLR、PPARA的mRNA和蛋白表达水平有关，这在一定程度上证明了本研究的可靠性[1]。

2.6 关键活性成分分析

为了明确作用于关键靶点PPARG、PPARA、LDLR的活性成分，使用Cytoscape软件构建成分-共有靶点-疾病网络(图4)，该网络包括21个节点及30条边，10个节点是共有靶点，另外10个节点则是与共有靶点有直接作用关系的成分。同时发现白藜芦醇与柚皮素是作用于关键靶点的成分，可能是DHG降脂作用的关键活性成分。

2.7 体外活性验证

图5 白藜芦醇、柚皮素对HepG2细胞内脂质堆积影响

HepG2细胞经油酸处理后，其形态与脂质堆积肝细胞相似[14-15]，是体外研究脂代谢的理想载体，故本研究采用油酸诱导的HepG2细胞脂质堆积模型验证白藜芦醇(Res)及柚皮素(Nar)的药效。油红O染色结果(图5)表明，经油酸处理后，模型组细胞外围轮廓变圆，细胞间距离增大，胞浆内颗粒状脂质被染成鲜红色，并呈戒指环状紧密地分布在细胞膜外，说明脂质堆积细胞模型建立成功。与模型组相比，10 μmol/L白藜芦醇及柚皮素均能够减少HepG2细胞内红色脂质含量。油红O染色定量测定结果表明，与对照组比较，模型组在510 nm处吸光值升高189.05%；与模型组比较，白藜芦醇组降低20.01%，柚皮素组降低31.61%，差异具有统计学意义，说明白藜芦醇、柚皮素能够显著降低HepG2细胞内脂质含量(图6A)。为进一步确定白藜芦醇、柚皮素的降脂效果，对细胞内TG含量进行测定(图6B)。结果表明，与对照组相比，模型组TG含量升高152.00%；与模型组比较，白藜芦醇组降低了53.06%，柚皮素组降低了27.89%，差异具有统计学意义，且白藜芦醇甚至可以将细胞内TG含量恢复至对照组同等水平，进一步说明白藜芦醇、柚皮素可显著降低HepG2细胞内脂质含量，可能为DHG降脂的关键活性成分。

2.8 质量标志物的确定

柚皮素和白藜芦醇在DHG中含量较低；而两者分别是DHG主要成分柚皮苷和虎杖苷的体内代谢产物，柚皮苷、虎杖苷进入体内后会在肝药酶、肠道菌群的作用下被迅速代谢为苷元-柚皮素、白藜芦醇[16-17]。文献报道对高脂血症仓鼠和家兔的研究发现虎杖苷可显著降低血清TC、TG和LDL-C水平[18-19]，而柚皮苷也可通过增强胆固醇的反向运输发挥较好的调节血脂的作用[20-21]，提示虎杖苷和柚皮苷可能通过原型及其苷元的形式同时发挥降脂药效。此外，白藜芦醇及柚皮素分别为蓼科植物二苯乙烯苷类以及柑橘属中药黄酮类生物合成途径的中心中间体[22-23]。虎杖苷和柚皮苷可分别由白藜芦醇和柚皮素通过其结构特定羟基位置的糖基化反应获得，而白藜芦醇在植物中含量极少，主要以虎杖苷的形式存在于虎杖植物中[24]；相似的，柚皮苷也是陈皮中主要的柑橘类黄酮[25]，因此白藜芦醇、柚皮素、虎杖苷、柚皮苷可作为DHG特征性成分；与此同时，课题组前期研究发现柚皮苷及虎杖苷在DHG中的含量分别为(3 085.40±74.30) μg/g及(2 592.40±102.00) μg/g，为DHG的主要成分；同时柚皮苷及虎杖苷在10批DHG制剂中的含量变化较小(90% ≤P≤110%，RSD≤15%)，能够稳定存在[26]。因此认为活性成分柚皮素、白藜芦醇的前体成分柚皮苷、虎杖苷可作为DHG治疗高脂血症的质量标志物。