RNA-seq技术分析宫颈癌与癌旁组织差异表达基因效果

谯 敏 黄树峰 武艳玲

广东省深圳市南山区蛇口人民医院妇科 518000

在妇科病恶性病变中宫颈癌是最常见的一种，诱发宫颈癌的高危因素是人乳头状瘤病毒(HPV)感染，但仅会在HPV持续感染致使细胞基因组出现异常后，方可最终诱发宫颈癌[1-2]。此次研究收集2019年7月—2020年6月本院收治的3例确诊为宫颈癌的患者，拟通过RNA-seq技术对宫颈癌及癌旁组织转录组进行分析，甄别出存在差异表达的基因，并进一步对与差异表达基因相关的融合基因、信号通路进行深入分析，进而明确宫颈癌的发病机制及特异分子标志物，为临床治疗及相关药物研究提供一定参考，报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2019年7月—2020年6月本院收治的3例确诊为宫颈癌的患者为分析对象，患者术前未接受药物治疗及放化疗治疗，病理学检查结果为宫颈癌ⅡB期，术后取宫颈癌及癌旁组织放置在RNA保存液中保存，其中癌旁组织与癌灶边缘距离在3cm以上。

1.2 提取RNA与质检 严格按照操作说明书通过QIAGEN微量RNA提取试剂盒进行宫颈癌及癌旁组织RNA提取，RNA完整性及纯度通过琼脂糖凝胶电泳法进行分析，RNA纯度应用Nanodrop检测，RNA浓度通过Qubit2.0予以精确定量，RNA完整性应用Agilent2100予以精确检测[3]。

1.3 构建文库与测序 真核生物mRNA应用Oligo磁珠富集，将fragmentationbuffer加入其中打断mRNA为短片段，mRNA为模板，通过六碱基随机引物合成一链cDNA，将DNA polymerase I、dNTPs、RNase H、缓冲液加入合成二链cDNA，通过A MPure XP beads 进行双链cDNA纯化。然后对纯化后的双链cDNA先行末端修复，再通过A MPure XP beads选择片段大小。PCR扩增并通过A MPure XP beads对PCR产物纯化，获得文库。构建完文库后，先通过Qubit2.0初步定量，文库稀释，通过Agilent2100检测文库插入片段，通过Q-PCR法精准定量文库有效浓度。文库检测达标后通过Illumina测序平台予以测序。

1.4 测序数据分析 测序数据质量集中在Q30以上，去除原数据中涉及有低质量碱基、接头信息、未检出碱基，获取最终有效数据。通过TopHat2软件序列对比参考基因组及获取的数据，比对至目标参考基因组上的通路称为Mapped Reads，通过Cufflinks软件转录本拼接Mapped Reads，并对宫颈癌及癌旁组织中的基因表达量进行计算。

1.5 筛选差异表达基因 通过Cufflinks软件分析，在检测样品差异表达RNA期间，将FDR<0.05且差异倍数(Fold Change)≥2定位筛选标准，Fold Change为两样品之间表达量比值。

1.6 分析差异表达基因本体与通路富集 通过IPA软件分析两组样本差异表达基因疾病功能富集、信号通路富集，通过软DAVID工具分析基因本体。

1.7 融合基因分析 通过TopHat fusion 进行分析，将未比对成功的通路打碎为25bp的片段，继而通过Bowtie把25bp片段比对至基因组，找到比对至同样染色体但位置不同的reads或比对至两个不同染色体的片段。

2 结果

2.1 差异表达基因分析 对比宫颈癌组织及其癌旁组织，总共发现差异表达基因1 746个，与癌旁组织相比，宫颈癌组织中表达量上调基因有754个，表达量下调基因992个。

2.2 基因本体及通路分析 差异基因中总计富集基因本体-BP582条，总计富集通路378条，差异基因主要富集在DNA损伤、细胞黏附相关的信号通路上，其中前5条最有意义的信号通路富集结果见表1。

表1 前5条最有意义的信号通路富集结果

2.2 融合基因分析 宫颈癌及癌旁组织中存在的融合基因详见表2。

表2 融合基因分析

3 讨论

高危型HPV持续感染虽然是诱发宫颈癌的最主要因素，但最终发展为宫颈癌的感染者也只是一小部分[4]。现阶段大量研究指出[5-6]，基因水平表达存在异常会直接导致宫颈癌。RNA-seq技术除了能对已知基因转录活动进行检测，还可对未知基因进行检测。

本文中，经RNA-seq技术分析共发现差异表达的基因有1 746个，其中表达上调基因754个，表达下调基因992个。功能富集性分析结果显示，差异基因中总计富集基因本体-BP582条，总计富集通路378条，差异基因主要富集在DNA损伤、细胞黏附相关的信号通路上。其中前两位通路都与细胞渗出及黏附密切相关，同时在细胞渗出与黏附中，细胞黏附分子发挥着重要作用。相关研究也指出[7]，在宫颈癌转移侵袭及发展过程中，细胞黏附因子也与之有密切关系。在恶变程度不同的宫颈癌中，活化白细胞黏附分子表达存在着差异，并且表达量表现出上升的趋势[8]。因此，推测在宫颈癌发生过程中，同细胞黏附有关的信号通路在其中发挥着一定作用。

融合基因属于嵌合基因，其编码蛋白一般都具有致癌性，对细胞功能会产生消极影响，是主要的致癌原因之一[9]。现阶段，在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等恶性病变中均有融合基因的身影，但该领域关于宫颈癌的研究尚无报道。本文中发现，较之癌旁组织，宫颈癌组织中均有程度不一的融合基因，其中在两个样本中均发现有RAB22A-BCAS1。RAB22A是重要的调节囊泡运输因子，RAB22A在肝癌、骨肉瘤、卵巢癌等多种肿瘤中存在过表达。乳腺癌BCAS1处在20q13.2区域，在乳腺癌发展中其高表达发挥着关键作用。此外，有研究指出[10]，BCAS1同胰腺癌、前列腺癌等也有密切关系。本文中所发现的RAB22A-BCAS1及其他融合基因是不是潜在的宫颈癌致癌基因，尚需进一步扩大样本量予以验证。

综上所述，RAB22A-BCASI融合基因、细胞黏附信号通路同宫颈癌发病机制存在相关性，可能是导致发生宫颈癌的原因。