新型酰胺类化合物的合成及其生物活性

吴通荣, 简荣超, 陈小乐, 唐小文, 李钰铃, 盛钊君, 吴盼盼, 洪为谦*

(1. 五邑大学 生物科技与大健康学院，广东 江门 529020；2. 江门市 大健康国际创新研究院，广东 江门 529000)

酪氨酸酶是一种含铜离子的氧化还原酶[1]。与黑色素合成密切相关，易引起果蔬酶促褐变及人体色素障碍性疾病[2]。酪氨酸酶抑制剂在医药、化妆品和农业中具有重要作用，因此，寻找高效、低毒、稳定的酪氨酸酶抑制剂具有广阔的前景[3]。

自由基具有强烈的氧化作用，与人体一些重大疾病有一定的相关性，正常情况下，生物体内自由基处于平衡性动态，机体的免疫和其他防御系统，包括酶和细胞膜本身，可以阻断它的损害[4]。然而过多的自由基会氧化各种酶和蛋白质的巯基，改变其功能和结构；还会损害核酸和染色体，从而诱发多种疾病，如癌症、动脉粥样硬化、心糖尿病和脑血管疾病等[5-6]。而抗氧化剂能够帮助人体祛除自由基，从而减少多种疾病(如癌症、动脉硬化和脑血管疾病)的发生。

Scheme 1

原儿茶酸具有抑菌[7]、抗炎[8]等多方面药理活性，是一种重要的天然活性物质。近年来的研究发现了原儿茶酸抗氧化[9-10]、抗癌及介导肿瘤细胞凋亡等许多新的药理作用[11]。胡椒酸是从胡椒中提取的一种芳香酸，目前研究发现它具有抗菌活性[12]，可抑制酪氨酸酶活性[13]，而且其衍生物胡椒酸乙二胺具有降血脂及抗氧化作用[14]。樊倩[15]等研究了一系列肉桂酰氨基酸酯类化合物，发现其中部分化合物的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性相较于肉桂酸有明显的提升，具有较好的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性。

将原儿茶酸、胡椒酸分别与具有生物活性的L-酪氨酸甲酯、D-酪氨酸酶甲酯、章胺、多巴胺通过酰胺键偶联，合成了原儿茶酸系列和胡椒酸系列化合物(Scheme 1)，其结构经1H NMR和13C NMR表征。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker 500 MHz型核磁共振仪(Methanol-d4为溶剂，TMS为内标)。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 原儿茶酸羟基保护产物(中间体)合成

将原儿茶酸15.412 g(100 mmol)溶于20 mL DMF中，0 ℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷60.288 g(400 mmol)，三乙胺调节pH 至9～10，室温反应20 h，以TLC检测反应终点(展开剂：石油醚/乙酸乙酯=12/1，V/V)，减压浓缩后加入15 mL THF/MeOH混合溶剂(2/1，V/V)，再加入适量饱和碳酸钾反应1～2 h。减压浓缩，浓缩液用DCM溶解后依次用2 M盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，收集有机相，干燥、减压浓缩得到粗产品，硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=15/1，V/V)纯化得中间体产物。

(2) 胺类化合物羟基保护产物(中间体)合成(以L-酪氨酸甲酯为例)

将L-酪氨酸甲酯19.522 g(100 mmol)溶于20 mL DMF中，0 ℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷(其中对L-酪氨酸甲酯和D-酪氨酸甲酯为200 mmol，章胺和多巴胺为300 mmol)，三乙胺调节pH至9～10，室温下反应20 h，以TLC检测反应终点(展开剂：二氯甲烷/甲醇=15/1，V/V)，反应液依次用2 M盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，收集有机相，干燥、减压浓缩得到粗产品，硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇=20/1，V/V)纯化得中间体产物。

(3) 化合物a～d合成(以a合成为例)

将原茶儿酸羟基保护产物0.200 g(0.523 mmol)溶于5～8 mL无水DCM中，加入EDCI(羧酸化合物的2 eq.)和HOBT(羧酸化合物的1.2 eq.)，0 ℃下搅拌10 min后加入胺类化合物的羟基保护产物(羧酸化合物的1.2 eq.)，三乙胺调节pH至9～10，室温反应过夜后，依次用2 M盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，收集有机相，干燥、减压浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=15/1，V/V)纯化得羟基被保护的酰胺产物，再定量加入1 M的四丁基氟化铵的THF溶液，室温反应2 h。反应完成后，浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇=24/1，V/V)纯化得目标产物。

a： 白色固体，收率 42.1%;1H NMRδ: 7.24(d,J=2.1 Hz, 1H, ArH), 7.18(dd,J=8.2 Hz, 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.08(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 6.80(d,J=8.3 Hz, 1H, ArH), 6.72(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 4.75～4.71(dd,J=8.9 Hz, 5.7 Hz, 1H, CH), 3.72(s, 3H, CH3), 3.16～3.03(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.64, 168.73, 155.95, 148.99, 144.88, 129.84, 127.70, 125.05, 119.43, 114.87, 114.39, 54.75, 51.29, 36.03, 25.50, 19.61, 12.55。

b： 白色固体，收率 42.1%;1H NMRδ: 7.24(d,J=2.1 Hz, 1H, ArH), 7.21～7.16(dd,J=8.2 Hz, 2.2 Hz, 1H, ArH), 7.08(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 6.80(d,J=8.3 Hz, 1H, ArH), 6.73(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 4.77～4.74(dd,J=8.9 Hz, 5.7 Hz, 1H, CH), 3.72(s, 3H, CH3), 3.14～2.99(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.65, 168.74, 155.95, 149.00, 144.88, 129.84, 127.69, 125.08, 119.43, 114.87, 114.39, 54.75, 51.30, 36.0, 25.67, 19.58, 12.58。

c： 白色固体，收率42.6%;1H NMRδ: 7.30～7.24(m, 3H, ArH), 7.23～7.17(dd,J=8.3 Hz, 2.1 Hz, 1H, ArH), 6.82～6.76(m, 3H, ArH), 4.80(q,J=5 Hz, 1H, CH), 3.60～3.47(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 169.14, 156.68, 148.80, 144.90, 133.37, 127.06, 125.54, 119.17, 114.68, 114.39, 114.28, 72.07, 12.55。

d： 白色固体，收率 40.9%;1H NMRδ: 7.28(d,J=2.1 Hz, 1H, ArH), 7.21～7.17(dd,J=8.3 Hz, 2.2 Hz, 1H, ArH), 6.81(d,J=8.3 Hz, 1H, ArH), 6.73～6.68(m, 2H, ArH), 6.61～6.57(dd,J=8.0 Hz, 2.1 Hz, 1H, ArH), 3.51(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 2.76(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2);13C NMRδ: 168.84, 148.76, 144.89, 143.36, 130.84, 125.72, 119.70, 119.08, 115.52, 114.96, 114.39, 114.23, 52.92, 41.58, 34.73, 26.54, 19.92, 12.74。

(4) 化合物e～h合成(以e合成为例)

将胡椒酸0.200 g(1.204 mmol)溶于5～8mL无水DCM中，定量加入EDCI(羧酸化合物的2 eq.)和HOBT(羧酸化合物的1.2 eq.)，0 ℃下搅拌10 min后加入胺类化合物的羟基保护产物(羧酸化合物的1.2 eq.)，三乙胺调节pH至9～10，室温反应过夜后，依次用2 M盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，收集有机相，干燥、减压浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=15/1，V/V)纯化得羟基被保护的酰胺产物，再定量加入1 M的四丁基氟化铵的THF溶液，室温搅拌2 h，反应完成后，浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇=30/1，V/V)纯化得目标产物。

e： 白色固体，收率 65.3%;1H NMRδ: 7.37～7.35(dd,J=8.1 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.25(d,J=1.7 Hz, 1H, ArH), 7.12～7.06(m, 2H, ArH), 6.89(d,J=8.2 Hz, 1H, ArH), 6.75～6.69(m, 2H, CH2), 6.05(s, 2H, CH2), 4.76～4.73(m, 1H, CH), 3.74(s, 3H, CH3), 3.17～3.01(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.53, 168.00, 155.98, 150.75, 147.90, 129.82, 127.69, 127.59, 122.18, 114.86, 107.48, 107.16, 101.83, 54.85, 51.32, 35.99。

f： 白色固体，收率 65.3%;1H NMRδ: 7.38～7.35(dd,J=8.1 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.25(d,J=1.7 Hz, 1H, ArH), 7.11～7.06(m, 2H, ArH), 6.88(d,J=8.1 Hz, 1H, ArH), 6.76～6.70(m, 2H, CH2), 6.04(s, 2H, CH2), 4.78～4.72(m, 1H, CH), 3.74(s, 3H, CH3), 3.17～3.02(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.51, 168.00, 155.98, 150.75, 147.91, 129.80, 127.69, 127.62, 122.18, 114.84, 107.48, 107.15, 101.84, 54.85, 51.30, 35.98。

g： 白色固体，收率 59.2%;1H NMRδ: 7.41～7.39(dd,J=8.2 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.30(d,J=1.7Hz, 1H, ArH), 7.26(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 6.89(d,J=8.1 Hz, H, ArH), 6.81～6.78(m, 2H, ArH), 6.04(s, 2H, CH2), 4.82～4.79(dd,J=7.9 Hz, 5.0 Hz, 1H, CH), 3.60～3.48(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 168.32, 156.71, 150.56, 147.93, 133.32, 128.18, 127.07, 121.93, 114.67, 107.47, 107.06, 101.80, 71.93, 52.67, 25.64, 19.56, 12.55。

h： 白色固体，收率 50.7%;1H NMRδ: 7.38～7.36(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H, ArH), 7.27(d,J=1.5 Hz, 1H, ArH), 6.86(d,J=8.1 Hz, 1H, ArH), 6.72(d,J=8.1, 2H, CH2), 6.58～6.56(dd,J=8.0 Hz, 1.8 Hz, 1H, CH), 6.02(s, 2H, CH2), 3.51(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 2.75(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2);13C NMRδ: 168.02, 150.47, 147.90, 130.80, 128.31, 121.84, 119.76, 115.57, 107.49, 107.02, 101.77, 41.67, 34.63, 25.49, 19.51, 12.58。

1.3 活性测试

(1) 酪氨酸酶抑制活性测试[16]

测定酪氨酸酶抑制活性，将96孔微孔板放入酶标仪中，使其温度达到37 ℃后，向96孔微孔板中依次加入80 uL的PBS缓冲溶液(0.05 mol/L， pH=6.81)， 10 μL的酪氨酸酶溶液，10 μL的样品溶液(2 mM)， 37 ℃下孵育10 min，其中振动30 s。孵育完成后，加入100 μL的L-多巴溶液引发反应，测定0 s与60 s的吸光度值。

(2) DPPH自由基清除试验[17]

测定DPPH自由基清除能力，取2 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH自由基的甲醇溶液与2 mL不同浓度的样品溶液混合摇匀。避光静置反应10 min后，测量其在波长517 nm处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 合成

通过羟基的硅醚化反应保护母体结构上的羟基，再经羧基与氨基的偶合反应合成酰胺类化合物，最后使用TBAF作为羟基的脱保护剂脱去羟基保护基团得到8个目标产物。所有目标分子都通过HPLC进行纯度分析，其结构经1H NMR和13C NMR表征。

2.2 活性

通过体外酪氨酸酶活性测试实验，对所合成的原儿茶酸系列和胡椒酸系列的酰胺类化合物在100 μM浓度下进行活性筛选，结果如表1所示，以原儿茶酸为母体结构合成的酰胺化合物比其母体结构对酪氨酸酶抑制活性有了一定的提高。而以胡椒酸为母体结构合成的酰胺化合物对酪氨酸酶的抑制活性比胡椒酸对酪氨酸酶的的抑制活性低，说明胡椒酸对酪氨酸酶的抑制活性可能很大程度来自其羧基。但化合物对酪氨酸酶的抑制活性均低于阳性对照物曲酸。

测试了化合物对 DPPH 自由基清除活性，结果分别见表2和表3。在50 μM的浓度下，a、b、c和h对DPPH自由基具有较强的清除能力，其对DPPH自由基的清除能力均高于原料化合物及阳性对照物抗坏血酸。结合化合物对酪氨酸酶的抑制活性，选择a、b和c，测定其对DPPH半数清除浓度，所得结果分别为6.1、 6.3和13.3 μM，均高于阳性对照物抗坏血酸(IC50=40.3 μM)。

表1 100 μM下化合物对酪氨酸酶的抑制率

表2 50 μM下化合物对DPPH自由基清除率

表 3 部分化合物对DPPH自由基的半数清除浓度

选取原儿茶酸和胡椒酸两种羧酸化合物，通过酰胺键与L-酪氨酸甲酯、D-酪氨酸甲酯、章胺、多巴胺4种具有生物活性的胺类的化合物偶联。成功合成了8个新型酰胺类化合物，其结构经1H NMR和13C NMR表征。测试目标产物的体外酪氨酸酶抑制活性和DPPH自由基清除能力，结果发现：以原儿茶酸系列作为母体结构与4种胺所合成的酰胺类化合物对酪氨酸酶的抑制活性比母体结构稍有提升；而以胡椒酸为母体结构合成的酰胺类化合物对酪氨酸酶的抑制活性比胡椒酸本身对酪氨酸酶的抑制活性低，说明胡椒酸对酪氨酸酶的抑制活性可能很大程度来自于其羧基。再通过对化合物进行的DPPH自由基清除能力试验，发现化合物a、b、c、d和h具有较强自由基清除能力。而化合物a、b和c不仅对酪氨酸酶具有一定的抑制活性，并且具有较强的DPPH自由基清除能力。