PAL探针中间体3-氧代-6-庚炔酸酯的合成方法改进

何冠涛, 方成乔, 罗旭娜, 苏金龙, 饶 雨, 林汉森

(广东药科大学 药学院，广东 广州 510006)

光亲和标记(photo-affinity labeling, PAL)自1962年首次报道以来[1]，迅速成为了药物与靶蛋白研究之间的重要桥梁，不仅可以指导先导物的筛选，更能够实现高效灵敏的药物受体识别[2]。PAL探针是目标化合物链接光反应性基团(photo-reactive group)以及报告基团(reporter group)的衍生物[3]，其中双吖丙啶类PAL探针的合成及其靶标识别研究已有许多相关报道[4-7]。基于PAL探针的设计原则[8]，李正球等[9-10]报道了一种具有简约结构特点的端炔基双吖丙啶类PAL的合成(Scheme 1)，同时证明了此类PAL探针具有良好的靶标识别性能，目前国内外已有各种靶蛋白研究采用此方法来合成PAL探针[11-16]。

Scheme 1

Scheme 2

在研究该中间体3-氧代-6-庚炔酸酯的合成方法时，发现上述制备方法略有不足：一方面，使用二异丙基氨基锂(LDA)直接与原料中的γ-H作用形成γ碳负离子，然而LDA的使用条件苛刻，反应需要在极低温(-78 ℃)、无水、无氧和氮气保护下进行，且后处理复杂，对仪器设备要求较高。另一方面，乙酰乙酸乙酯具有更加活泼的α-H，可与LDA作用形成α碳负离子，因此上述方法在原料与溴丙炔的亲核取代中，往往会生成大量的α-取代物和α,γ-二取代物，而γ-取代物3-氧代-6-庚炔酸乙酯的实际收率仅有5%～15%，且重现性较差，难以达到预定的效果。为此，改进了3-氧代-6-庚炔酸酯的合成工艺(Scheme 2)：利用二异丙胺氨解乙酰乙酸乙酯生成N,N-二异丙基乙酰基乙酰胺1，减弱α-H酸性，增大α-位空间位阻。之后再与3-溴丙炔进行亲核取代，经硅胶柱层析分离得到α-取代物2与γ-取代物3，两者比例为1/9，反应的区域选择性以及γ-位目标取代物的收率均有所提高。3再经水解与酯化一锅法反应得到3-氧代-6-庚炔酸甲酯3a。优化后的工艺操作简便、后处理简单、反应条件温和，目标产物总收率可达43.3%。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AVANCEⅢ 600 MHz型超导核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；6210 ESI-TOF型高分辨质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)N,N-二异丙基乙酰基乙酰胺(1)的合成

称取乙酰乙酸乙酯2.3 g(18.0 mmol)、二异丙胺3.6 g(36.0 mmol)，85 ℃反应4 h后冷却至室温，加水30 mL，搅拌，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，饱和氯化钠水溶液(50 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得深黄色油状液体13.10 g，收率93.0%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 3.70～3.63(m, 2H), 3.33(s, 2H), 2.08(s, 3H), 1.23～1.22(d,J=6.7 Hz, 6H), 1.03～1.02(d,J=6.7 Hz, 6H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 202.74, 165.25, 52.01, 45.77, 29.73, 20.18; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C10H19NO2{[M+H]+}186.1494, found 186.1489。

(2)α-取代物(2)和γ-取代物(3)的合成

称取化合物13.1 g(16.7 mmol)，氢化钠0.8g(33.4 mmol)溶解于20 mL四氢呋喃中，冰水浴下搅拌0.5 h后，缓慢滴加3-溴丙炔2.0 g(16.7 mmol)，低温反应2 h(TLC监测)。加水40 mL和乙酸乙酯40 mL，搅拌，分液，水层用乙酸乙酯(2×30 mL)萃取。合并有机层，饱和氯化钠水溶液(50 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]纯化得α-取代物2和γ-取代物3。

Scheme 3

α-取代物2： 黄色油状液体0.3 g，收率 8.0%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 4.24～4.17(m, 2H, 8,11-H), 3.78～3.75(t,J=7.5 Hz, 1H, 2-H), 2.84～2.67(m, 2H, 5-H), 2.16(s, 3H, 4-H), 2.00～1.99(t,J=2.7 Hz, 1H, 7-H), 1.24～1.23(d,J=6.7 Hz, 6H, 12,13-H), 1.21～1.20(d,J=6.7 Hz, 6H, 9,10-H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 202.88, 166.76, 81.20, 70.53, 57.60, 46.62, 27.07, 20.73, 20.25, 18.67; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C13H21NO2{[M+H]+}224.1650, found 224.1645。

γ-取代物3： 黄色油状液体2.7 g，收率 72.4%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 3.83～3.76(m, 2H, 8,11-H), 3.48(s, 2H, 2-H), 2.80～2.77(t,J=7.2 Hz, 2H, 4-H), 2.45～2.42(td,J=7.2, 2.7 Hz, 2H, 5-H), 1.91～1.90(t,J=2.7 Hz, 1H, 7-H), 1.36～1.35(d,J=6.7 Hz, 6H, 12,13-H), 1.16～1.15(d,J=6.7 Hz, 6H, 9,10-H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 202.93, 165.26, 83.00, 68.84, 51.33, 46.18, 41.47, 20.50, 12.98; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C13H21NO2{[M+H]+}224.1650, found 224.1645。

(3) 3-氧代-6-庚炔酸甲酯(3a)的合成

在装有化合物32.7 g(12.1 mmol)的反应瓶中加入无水甲醇15 mL，油浴加热升温，搅拌下缓慢滴加80%硫酸15 mL，回流反应10 h。反应液缓慢倒入冷水50 mL中，搅拌，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(50 mL)和饱和氯化钠水溶液(50 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得浅黄色油状液体3a1.3 g，收率64.3%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 3.71(s, 3H), 3.46(s, 2H), 2.79～2.77(t,J=7.2 Hz, 2H), 2.46～2.43(td,J=7.2, 2.7 Hz, 2H), 1.94～1.93(t,J=2.7 Hz, 1H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 200.55, 169.76, 83.97, 68.24, 51.92, 48.99, 42.58, 12.83; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C8H10O3{[M+H]+}155.0708, found 155.0703。

2 结果与讨论

2.1 γ-取代物3的合成方法改进与工艺优化

通过二异丙胺氨解乙酰乙酸乙酯生成N,N-二异丙基乙酰基乙酰胺1后，反应起始物的α-位附近被引入一较大的供电子位阻基团，因此α-H的酸性减弱，同时α-位附近的空间位阻效应增大，阻碍了α碳负离子的形成及其对3-溴丙炔的进攻(Scheme 3)。改进后的亲核取代反应具有更好的区域选择性，α-取代物大大减少，γ-取代物明显增多，两者比例可达1/9，提高了后续合成3-氧代-6-庚炔酸酯的效率。

亲核取代中选择不同的碱对反应的影响也较大，一般的选择有：LDA、正丁基锂、氢化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾。考虑到使用LDA和正丁基锂所附带的危险性，我们考察了氢化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾4种相对较稳定的碱的催化效果，用量均为2 eq.。结果显示，使用叔丁醇钾时，1尚未完全转化，α-取代物与γ-取代物比例约2/9，反应或需要更长的时间。而选择使用氢化钠时，1可完全反应，TLC显示原料点消失，经柱层析纯化后γ-取代物收率最佳，两种取代物比例达到1/9。使用甲醇钠、乙醇钠时可见原料点基本消失，两种取代物比例分别约为2/7和1/5，对比使用氢化钠，反应生成的杂质斑点更加明显。相比LDA，使用氢化钠的反应体系更加温和、操作简便、后处理简单，因此选择氢化钠代替LDA催化亲核取代反应。

Scheme 4

2.2 3-氧代-6-庚炔酸甲酯3a的合成工艺优化

使用一锅法合成3-氧代-6-庚炔酸甲酯3a，反应首先由γ-取代物3水解脱去位阻基团得到β-羰基羧酸，紧接着与甲醇酯化生成目标化合物(Scheme 4)。酰胺键的水解活性较低，需要在高温以及浓酸或浓碱催化下长时间反应，但过高的反应温度可能会导致水解物β-羰基羧酸发生脱羧，因此本研究选择在100 ℃下使用浓硫酸催化水解以及进一步的酯化。在实际操作中，直接使用市售98%浓硫酸往往容易造成严重的碳化现象，导致后处理困难，影响收率。在考察使用不同浓度的浓硫酸(70%～90%)后发现，随着硫酸浓度的升高，水解与酯化反应更加彻底，而在80%浓硫酸催化下效果最佳，收率约64%，同时避免了原料与产物被碳化。

以乙酰乙酸乙酯为原料，通过氨解引入N,N-二异丙基成酰胺以添加空间位阻效应后进行亲核取代，得到α-和γ-两种取代物比例为1/9，提高了反应的区域选择性，且γ-取代物的收率达到72.4%，对比原路线中5%～15%的实际收率有所提升。γ-取代物再经水解与酯化一锅法反应成功地合成了目标化合物3-氧代-6-庚炔酸甲酯，3步反应总收率43.3%。改进优化后的3-氧代-6-庚炔酸酯合成方法具有成本低、操作处理简单、反应条件温和等优点。