两种铜卟啉金属有机框架对小鼠乳腺癌细胞的光动力作用

2021-01-28江倩倩邵福平张孟孟尹登科

合成化学 2021年1期

江倩倩, 邵福平, 张孟孟, 杨晔,2,3, 尹登科,2,3

(1. 安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012； 2. 安徽省中医药科学院药物制剂研究所，安徽合肥 230012；3. 安徽省教育厅现代药物制剂工程技术研究中心，安徽合肥 230012)

光动力疗法(Photodynamic Therapy， PDT)是一种新兴的癌症治疗技术[1-3]，它是指在特定波长的光照射下，光敏剂将光能转移给组织氧，产生以单线态氧为主的活性氧物质(Reactive Oxygen Species， ROS)进而诱导肿瘤细胞凋亡的过程[4-7]。其治疗效果主要受肿瘤部位氧气浓度的影响，然而，大多数肿瘤组织的乏氧性质极大地限制了PDT的效率[8-10]，并且肿瘤在缺氧过程中，会产生H2O2等不良代谢物，这些代谢物会促进肿瘤细胞的转移[11]。近年来，有研究发现[12-14]，过氧化氢酶及部分金属化合物可通过催化肿瘤微环境中的H2O2，实现催化产氧，改善光动力治疗效果。另外，由于以5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉为配体制备的金属-有机框架(Metal-Organic Frameworks，MOFs)具有光敏性好，热稳定，不易淬灭等特点，也常被用于光动力治疗中[15-17]。

因此，本文以5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉为原料，采用分层法与溶剂热法分别制备MOF1和MOF2，对其结构和形貌进行表征。并将其应用于肿瘤光动力治疗中，考察两种材料对内源性H2O2的催化产氧作用，及在光动力作用下对4T1细胞的抑制作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SPECORD S600型紫外可见分光度计；Thermo Fisher Nicolet 6700型红外光谱仪(KBr压片)；PHILIPS PANalytical X’Pert 型X-射线衍射仪；Hitachi HT-7700型透射电子显微镜；Sirion 200型扫描电子显微镜。

5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉，郑州艾克姆化工有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成制备

(1) 分层法制备MOF1[18]

称取氯化铜85.24 mg(0.5 mmol)加至50 mL甲醇中，再称取H2TPyP 70 mg(0.1 mmol)加至50 mL氯仿中溶解后，各取10 mL混合均匀，室温下避光反应24 h。离心15 min，真空干燥得紫红色粉末状MOF1 12.13 mg，收率89.2%；UVλmax: 424, 555, 594 nm; IRν: 3090(C—H), 2920(C—H), 1610(C=C), 1350(C=N), 972(Cu—N), 815(C—H), 715(C—H) cm-1; 晶胞参数a=13.636(3) Å,b=13.636(3) Å,c=19.467(4) Å,α=90°,β=90°,γ=90°。

(2) 溶剂热法制备MOF2[19]

称取H2TPyP 618 mg(0.1 mmol)与乙酸铜一水合物1.0 g(0.5 mmol)溶于50 mL乙酸中，125 ℃恒温回流6 h。蒸发除溶剂后，将所得混合物加入50 mL水中，室温搅拌30 min并加入0.5 mL吡啶。经三氯甲烷多次萃取，水浴蒸干即得紫红色粉末状MOF2 65.07 mg，收率95.7%；UVλmax: 420, 540, 587.5; IRν: 3320(—CH3), 3020(C—H), 2923(C—H), 1590(C=C), 1350(C=N), 970(Cu—N), 810(C—H), 725(C—H) cm-1; 晶胞参数a=b=96.3568 Å,c=12.9808 Å,α=90°,β=90°,γ=120°。

1.3 催化过氧化氢

37℃下在含H2O2(20 mmol·L-1)的Tris-HCl缓冲液(pH=7.4， 10 mmol·L-1)中加入MOF1和MOF2粉末(300 μg·mL-1)。分别在0、 10、 20、 30、 60和90 min时，将混合物离心，取上清液置于石英比色皿中，使用紫外全波长进行检测。

1.4 1O2的制备

精密称取DPBF 0.15 mg，溶解于0.5 mL DMSO中。用脱气处理后的19.5 mL Tris-HCl(pH=7.4， 10 mmol·L-1)将DPBF溶液稀释至7.5 μg·mL-1。再将10 mg MOF1和MOF2粉末分别加入含DPBF的Tris-HCl缓冲液中，超声分散。以同等体积的DMSO与Tris-HCl缓冲液混合制备参比溶液进行校零。

经532 nm的激光照射0、 30、 60、 90、 120和150 s后取样，使用紫外分光光度计检测350 ～ 500 nm处DPBF的吸光度。

1.5 细胞毒性

采用MTT法测试了材料在523 nm的激光照射(200 mW·cm-2， 10 min)下对小鼠乳腺癌细胞(4T1)的光动力作用[20]。

1.6 ROS生成

采用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐作为荧光探针对铜卟啉金属有机框架细胞内ROS产生能力的考察。以 2×105个细胞/孔的密度将4T1细胞接种于铺有无菌细胞爬片的24孔板中，分别设置对照组、MOF1组、MOF2组、MOF1+H2O2(1 mM)组、MOF2+H2O2(1 mM)组。培养24 h后，移去原培养基，加入相应制剂继续孵育24 h。弃去原培养基, 每孔再加入 DCFH-DA 溶液(1 mL, 10 μM)孵育30 min，经532 nm激光照射(200 mW·cm-2， 2 min)后，PBS清洗3遍，用多聚甲醛固定细胞30 min后，DAPI染核5 min ，甘油封片，荧光显微镜下观察拍照，并用ImageJ软件分析细胞内荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 铜卟啉金属有机框架物

由铜卟啉金属有机框架的红外光谱可见，H2TPyP在3347 cm-1有卟吩环上的N—H伸缩振动吸收峰，MOF1与MOF2中无此吸收峰，这是由Cu2+与H2TPyP配位取代了卟吩内环上的两个H所致。另外，由于金属离子进入卟啉环内形成配合物后，卟啉环上的对称性提高，MOF1、 MOF2相对于H2TPyP来说，其紫外光谱表现为Q带吸收峰的个数减少，Soret带发生红移。

图1(A～B)MOF1和MOF2的TEM图；(C～D)MOF1和MOF2的SEM图

从TEM和SEM的结果(见图1和图2)可看出，MOF1呈八面体状，粒径约为100 nm， MOF2呈厚片状，尺寸约为1 μm。

2.2 铜卟啉金属有机框架催化过氧化氢的能力

为考察MOF1和MOF2是否能够催化过氧化氢产生氧气。分别在H2O2中加入相同量的MOF1和MOF2，反应一段时间后，测定两组剩余的H2O2紫外吸收。结果见图2，加入铜卟啉金属有机框架后，随着时间的增加，H2O2紫外吸收峰强度逐渐降低，且MOF1的降低程度均大于MOF2。结果表明，铜卟啉金属有机框架具有催化H2O2分解生成O2的能力，且MOF1催化H2O2的能力大于MOF2。

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2.3 铜卟啉金属有机框架在光照下产生1O2的能力

DPBF是一种1O2捕获剂，当被1O2氧化后，其在426 nm左右的吸光度显著降低，故目前被广泛用于衡量产生1O2的能力(图3)， 150 s内MOF1组吸光度值降低了0.2950而MOF2组吸光度值降低了0.1689。结果表明：MOF1和MOF2均可通过催化H2O2产氧来增强1O2的生成能力，且MOF1的催化能力更强。

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2.4 铜卟啉金属有机框架对4T1的细胞毒性

MTT实验结果见图4，对材料组添加光照后，随着其浓度的增加，MOF1或MOF2的细胞毒性均逐渐增强，且当浓度 ≥12.5 μg·mL-1，MOF1的细胞光毒性大于MOF2(P<0.001)。

2.5 铜卟啉金属有机框架细胞内ROS产生能力

DCFH-DA是检测细胞内ROS水平的荧光探针，其本身没有荧光，可自由穿过细胞膜。进入细胞后，可被细胞内的酯酶水解成DCFH，而DCFH无法透过细胞膜，因此易积聚在细胞内，细胞内的ROS可将无荧光的DCFH 氧化生成有绿色荧光的DCF。由于细胞内H2O2浓度较低，为方便对比催化效果，实验时添加了外源H2O2。如图5所示，MOF1+H2O2组、MOF2+H2O2组有较强的绿色荧光，且前者荧光强度大于后者(P<0.001)。说明加入的铜卟啉金属有机框架主要是通过催化H2O2来提高细胞内活性氧的产生水平，且MOF1催化H2O2能力大于MOF2。