柠檬酸和乙酸对致腐假单胞菌的抗生物被膜研究

姜春新 王雅莹 洪小利 李春柳 张 蕾 朱军莉

(浙江工商大学食品与生物工程学院/浙江省食品安全重点实验室,浙江 杭州 310018)

假单胞菌(Pseudomonasspp)是一类革兰氏阴性菌,严格好氧菌,其环境适应能力强,在有氧条件下分解食品中蛋白质和脂肪的能力强,是影响冷链物流的重要致腐微生物。其中,荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)作为嗜冷菌,是引起低温水产品、奶类等食品低温腐败变质的主要细菌之一[1];隆德假单胞菌(Pseudomonaslundensis)也参与冷藏肉类和奶类等动物性食品腐败进程[2]。生物被膜是细菌为适应生存环境,附着于活性或惰性实体表面,被细菌胞外基质包裹的结构性微生物群落[3]。生物被膜及其胞外分泌物能够为细菌提供特殊的微环境,使其免受温度、抗生素、pH等外部环境因素的侵害,降低多种消毒措施和防腐剂对其的不良影响[4]。假单胞菌在低温下更易形成生物被膜,从而很难从食品接触面和加工设备中清除,导致食品加工环境中的交叉污染[5-6]。

乙酸(acetic acid,AA)、柠檬酸(citric acid,CA)等有机酸作为食品的酸化剂和抑菌剂,被美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)评价为一般公认安全(gernerally recognized as safe,GRAS)添加剂。研究表明,有机酸对致泻性的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌等多种食源性致病菌表现良好的抑菌性,抑菌活性取决于细菌胞内酸根离子的聚集,而细菌胞内外pH梯度及胞外酸根离子浓度影响聚集程度[7]。此外,有机酸还可抑制细菌生物被膜的形成[8],其中低浓度CA可抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的生成[9],苯乳酸能有效减少多糖分泌而抑制粪肠球菌生物被膜的形成[10],儿茶酸可降低副猪嗜血杆菌生物被膜的形成能力[11]。目前有机酸对食品微生物控制研究多集中在抑菌活性方面[12-13],而有关其对微生物生物被膜影响的报道较少。鉴于此,本研究以食品致腐荧光假单胞菌和隆德假单胞菌为试验对象,分析CA和AA对假单胞菌生物被膜形成、粘附和致腐性的影响,旨在为有机酸在生鲜食品保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

荧光假单胞菌PF07和隆德假单胞菌PS28分别分离自冷藏腐败的大黄鱼和牛肉,细菌经纯化和鉴定后保存于浙江工商大学食品微生物安全与控制实验室,其16S rDNA的NCBI登录号分别为KU173832和MK041549。将本实验室-80℃保存的2株甘油菌接种于LB(luria-bertani)培养基,28℃连续过夜活化后,待用。

CA和AA(均为分析纯≥99.5%),购自国药集团化学试剂有限公司;SYT09和PI荧光染料购自美国Thermo Fisher Scientific公司;LB肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)和营养琼脂,购自青岛海博生物技术有限公司;冰鲜养殖大黄鱼购自杭州下沙高沙农贸市场。

1.2 主要仪器与设备

VICTOR X酶标仪,美国Perkin Elmer公司;UV-1800紫外分光光度计,日本SHIMADZU公司;Zeiss LSM 710共聚焦扫描显微镜,德国蔡氏公司;CX22光学显微镜,日本OLIPUS公司;SPX-150B-Z生化培养箱,上海博讯公司;3-18K离心机,美国SIGMA公司;KDN-103F自动定氮仪,上海纤检仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 假单胞菌最小抑制浓度(minimuminhibitory concentration,MIC)测定 将CA和AA分别用灭菌水配制成浓度为100 mg·mL-1的溶液,采用二倍稀释法测定MIC[14]。将过夜活化的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌菌液以104～105CFU·mL-1接种于含有1.7～2.2 mg·mL-1CA及0.7～1.2 mg·mL-1AA的TSB培养基,28℃培养,每4 h取样测定600 nm波长处的吸光度值(OD600),绘制生长曲线,确定MIC。

1.3.2 生物被膜和胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)含量测定 将含有亚抑菌浓度有机酸,即1/4 MIC、1/2 MIC CA(0.55 mg·mL-1和1.10 mg·mL-1)和AA(0.25 mg·mL-1和0.50 mg·mL-1)的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌菌液分别添加至96孔板中,每孔200μL,以未添加有机酸的TSB菌液为对照,28℃静置培养24 h后,采用结晶紫染色法测定生物被膜含量[15]。具体方法:每孔用250μL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)轻轻漂洗3次,去除孔板中菌液,干燥,然后加入200μL 0.2%结晶紫溶液染色15 min,用PBS清洗后干燥,最后加入200 μL 75%乙醇,采用酶标仪测量590 nm波长处的吸光度值(OD590)。

取制备的含有亚抑菌浓度有机酸的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌菌液分别添加至6孔板中,每孔9 mL,28℃静置培养24 h,去浮游菌后,用PBS重悬菌体,50 kHz超声5min后,80℃加热30min提取。取上清采用苯酚-硫酸法测定EPS含量。

1.3.3 细菌薄膜观察 取1.3.2制备的TSB对照和含亚抑菌浓度有机酸的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌菌液分别添加至6孔板,每孔9 mL,28℃静置培养24 h后,用无菌牙签挑破薄膜并透光进行薄膜定性观察。

1.3.4 细菌粘附性观察 取1.3.2制备的对照和含亚抑菌浓度有机酸的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌菌液分别添加至24孔板(每孔含有1片玻璃片),每孔2 mL,28℃培养24 h后取出玻片,用0.85%生理盐水洗脱3次后,将玻片上粘附的被膜菌用0.1%结晶紫染色1 min,水洗干燥后在光学显微镜下观察。

1.3.5 共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察生物被膜 取1.3.2制备的对照和含亚抑菌浓度有机酸的荧光假单胞菌菌液分别添加至培养小皿,每小皿3 mL,28℃静置培养24 h,SYTO9-PI染液处理后,CLSM观察生物被膜结构,其中生物被膜活菌染上SYTO9为绿色和死菌染上PI为红色[5]。

1.3.6 细菌运动性测定 参考Li等[6]的方法。在LB肉汤中分别添加0.5%和0.3%琼脂配制成蜂拥培养基和泳动琼脂培养基,2种培养基灭菌后冷却至50℃左右,分别加入1/4 MIC、1/2 MIC的CA和AA,倾注平板。待琼脂平板凝固干燥后,将5μL过夜活化的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌菌液分别接种至平板中心,28℃静置培养,每隔12 h测量细菌的运动直径。

1.3.7 细菌蛋白酶活性测定 参考葛阳杨等[16]的方法提取无菌鱼汁,将2种假单胞菌以1‰接种量接种于含1/4 MIC、1/2 MIC CA和AA的鱼汁培养基中,4℃冷藏6 d,采用福林酚法测定鱼汁中假单胞菌的蛋白酶活性[16]。

1.4 数据处理

抑菌活性和生物被膜等试验均设3或5个重复,采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0软件进行数据处理和作图,并利用SPSS 19.0软件的AVOVA进行方差分析,P＜0.05表示有统计学显著性差异,结果为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸和乙酸对假单胞菌生长的影响

有机酸对大多数微生物具有抑菌作用,其抑菌活性主要受疏水性、未离解酸水平和pH值等因素的影响[7]。由图1可知,对照组荧光假单胞菌在培养4 h后进入对数生长期,细菌数量增长明显,培养28 h后进入稳定期。CA浓度高于1.7 mg·mL-1时明显抑制荧光假单胞菌的生长,而浓度高于2.1 mg·mL-1时菌体基本不生长;AA浓度高于0.7 mg·mL-1时荧光假单胞菌生长受到抑制,浓度高于1.0 mg·mL-1时菌体基本不生长。因此,CA和AA对荧光假单胞菌的MIC分别为2.1和1.0 mg·mL-1。试验过程中发现,2种有机酸对隆德假单胞菌的MIC也为2.1和1.0 mg·mL-1,均具有浓度依赖性(结果未显示),其中AA表现更强的抑菌活性。进一步发现1/2 MIC和1/4 MIC的CA和AA不影响2种假单胞菌的生长。

2.2 柠檬酸和乙酸对假单胞菌生物被膜形成的影响

亚抑菌浓度CA和AA对2种假单胞菌生物被膜形成的影响结果如图2所示。经结晶紫染色发现,荧光假单胞菌和隆德假单胞菌培养24 h的生物被膜量分别达到2.34和2.40(OD590),提示两分离株为强生物被膜形成菌。与对照组相比,2种有机酸浓度为1/4 MIC和1/2 MIC时,荧光假单胞菌生物被膜量分别减少了25.30%和47.11%(CA)、33.45%和53.00%(AA),而隆德假单胞菌的生物被膜量分别减少了25.29%和43.95%(CA)、33.14%和52.19%(AA)。表明AA和CA在亚抑菌浓度下,能显著抑制2种假单胞菌生物被膜的形成(P＜0.05)。

2.3 柠檬酸和乙酸对假单胞菌胞外多糖分泌的影响

EPS是生物被膜胞外分泌物的重要组分,具有填补细胞间隙、聚集细胞等作用。细菌EPS大量聚集使生物被膜加厚,可增强抵御消毒剂、抗生素等不良因子的破坏能力[3]。由图3可知,经24 h培养后隆德假单胞菌较荧光假单胞菌分泌更多的EPS,亚抑菌浓度CA和AA处理后菌体的EPS分泌量显著降低(P＜0.05),1/4MIC、1/2MIC CA处理下荧光假单胞菌的EPS分泌量分别降低了15.57%和44.19%,1/4MIC、1/2MIC AA处理导致EPS分泌量分别降低了39.65%和54.43%;而隆德假单胞菌在1/4MIC、1/2MIC CA作用下EPS分泌量分别降低了22.69%和42.67%,在1/4MIC、1/2MIC AA作用下EPS分泌量分别降低了39.51%和57.85%。此外,亚抑菌浓度下,AA比CA具有更强的EPS抑制活性。

2.4 柠檬酸和乙酸对气液间薄膜形成的影响

薄膜是指细菌在静置培养时气体与液体交界面形成的一类生物被膜,由大量菌体和胞外聚合物组成。由图4可知,对照组28℃培养24 h后菌液上层覆盖着一层不透明、致密的薄膜,用牙签划至薄膜表面具有粘稠、不易破裂的特点,且薄膜易粘在牙签上被带动,提示假单胞菌分泌聚合物的能力强。添加1/2 MIC CA和AA后薄膜变得较脆,易划破,且AA处理下形成的薄膜更脆。2种有机酸在1/4 MIC浓度作用下薄膜形成质感略有影响,经24 h培养后的薄膜仍较粘稠。

2.5 假单胞菌粘附性和生物被膜结构观察

采用显微镜观察荧光假单胞菌和隆德假单胞菌的粘附和生物被膜结构,结果如图5所示。对照组荧光假单胞菌和隆德假单胞菌的粘附菌量较多,且聚集成团块,其中隆德假单胞菌菌体染色较深。而亚抑菌浓度CA和AA处理后,对玻璃片上菌体形态无影响,但粘附量明显减少,尤其是1/2 MIC CA和AA处理下菌体分布稀疏,粘附菌减少约10倍。CLSM观察发现培养24 h后的荧光假单胞菌生物被膜较致密,厚度约50 μm,SYTO9绿色荧光强度明亮,而亚抑菌浓度2种有机酸处理下荧光假单胞绿色荧光信号下降,生物被膜变薄,其中在1/2 MIC CA和AA作用下生物被膜厚度分别减少至9.8μm和10.2μm。且处理组生物被膜中PI红色荧光信号增强,表现出浓度依赖性,尤其是AA处理组。结果提示CA和AA分子能渗透至复杂的生物被膜内部,导致被膜菌体的死亡。相对于CA,AA处理后荧光假单胞菌被膜厚度无显著差异,然而被膜菌分布更稀疏,死细胞明显增多。

2.7 柠檬酸和乙酸对假单胞菌运动性的影响

细菌生物被膜的形成与其运动性密切相关,其中菌体表面的鞭毛使细菌接触介质表面,促进生物被膜初期形成[17]。图6显示了亚抑菌浓度CA和AA对致腐性假单胞菌蜂拥性和泳动性的影响。荧光假单胞菌在2种运动琼脂上形成明显的蜂拥圈和泳动圈,经1/4 MIC CA处理24 h的荧光假单胞菌蜂拥圈减少53.2%。培养36 h后荧光假单胞菌对照组泳动直径为7.4 cm,经1/4 MIC CA处理的荧光假单胞菌胞菌泳动圈减少12.2%。而1/2MIC CA、1/4MIC AA及1/2MIC AA处理后的荧光假单胞菌均未出现运动性。试验过程中发现,隆德假单胞菌与荧光假单胞菌表现出相似的运动性。结果表明,CA和AA对2种假单胞菌鞭毛的运动性减弱,尤其是AA。

2.8 柠檬酸和乙酸对假单胞菌蛋白酶活性的影响

某些假单胞菌是冷藏牛肉和海鲜等富含蛋白质食品的特定腐败菌,其致腐性与其高蛋白酶活性有关[18]。蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。由图7可知,2种假单胞菌均能分泌具有较高活性的蛋白酶,其中隆德假单胞菌分泌蛋白酶的活性更高。亚抑菌浓度CA和AA的添加显著降低了2种假单胞菌分泌的蛋白酶活性(P＜0.05)。冷藏6 d后,1/4MIC、1/2MIC CA和AA处理下荧光假单胞菌的蛋白酶活性分别降低25.13%和26.53%(CA)、28.43%和29.03%(AA),隆德假单胞菌的蛋白酶活性分别降低22.21%和26.60%(CA)、31.90%和34.10%(AA),其中AA抑制蛋白酶活性效果更强。

3 讨论

假单胞菌属是冷藏生鲜动物性产品和水产品中的优势腐败菌[19],且为强生物被膜生成菌。本研究发现,CA和AA对2种致腐假单胞菌均有相似的抑制活性,CA和AA的MIC分别为2.1和1.0mg·mL-1,已报道乳酸对阴沟肠杆菌的MIC为5 mg·mL-1[10]。大多数微生物对有机酸都比较敏感,这与弱酸比强酸更容易扩散至菌体细胞膜有关,未解离的有机酸分子具有亲脂性,迅速进入细胞膜后会降低细胞周质和胞内pH值,解离细胞内部成分,破坏细菌的生理功能。相对于CA,AA抑菌效果更好,可能是因为AA的解离常数比CA高,解离H+的速度更快,使环境的pH值更低[7]。

生物被膜的形成增强了食品中致病菌和腐败菌细胞对环境消毒剂和抗生素的抵抗能力,会导致持续性污染[4]。本研究结果表明,亚抑菌浓度CA和AA均能显著抑制生物被膜形成、EPS分泌、粘附性及薄膜形成,并表现出浓度依赖性。Amrutha等[20]也报道了AA、CA和乳酸可抑制新鲜果蔬中大肠杆菌和沙门氏菌生物被膜的形成。在0.5%和1%乙酸作用下铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生物被膜完全被抑制[21]。相对于CA,AA对2种假单胞菌生物被膜抑制作用更强,CLSM观察也证实有机酸不仅降低了被膜的厚度和致密性,而且还能促进被膜菌的死亡。EPS是由菌体分泌的多糖基质、蛋白质、核酸等形成的具有高度组织化三维结构的胞外聚合物。本研究结果发现2种有机酸分子均能抑制EPS分泌量,从而影响了气液交界面中薄膜的特性,酸根离子还可进入复杂EPS内部,促进菌体死亡。

菌体运动性对生物被膜形成初期的微菌落及其发展具有重要作用,细菌依靠鞭毛粘附在物体表面,并通过鞭毛在表面的游动使膜不断变厚。本研究表明,亚抑菌浓度的CA和AA对荧光假单胞菌运动性的抑制效果明显,且AA作用下假单胞菌运动性微弱。相似地,鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)在0.2%肉桂酸、0.6%乳酸和0.4%丙酸作用下能显著减少运动性[22]。Minamino等[23]报道菌体在弱酸存在条件下,pH值由7.0向5.0适应过程中表现急剧降低泳动速度,细胞内质子浓度的增加导致大肠杆菌和沙门氏菌运动能力丧失。液相环境中pH值变化还可直接影响菌体的表面电荷特性,从而改变其在载体表面附着的动力学过程。因此,推测可能是CA和AA导致假单胞菌细胞内外质子浓度增加,鞭毛转速降低,菌体运动性下降[19],从而干扰早期粘附和菌落聚集,抑制生物被膜的形成。

胞外蛋白酶活性是评价高蛋白食品中腐败菌致腐能力的重要指标[1]。亚抑菌浓度AA和CA显著降低了2种假单胞菌的蛋白酶活性。可能是质子化弱酸扩散入细胞内,在细胞质中解离,降低了酸敏感的酶活性[24]。多数细菌为了生存会启动酸应激应答恢复胞内pH稳定[25],如有研究报道弱有机酸降低了伯氏疏螺旋菌(Borreliaburgdorferi)细胞质pH值,从而引起酸性应激反应及RpoN和RpoS依赖性基因表达,提高环境耐受性[26]。前期研究表明,食品腐败菌生物被膜形成和致腐能力与群体感应调控密切相关[27-28],然而其分子调控机制仍有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明,CA和AA在1/4 MIC和1/2 MIC亚抑菌浓度下能有效抑制2种致腐假单胞菌生物被膜形成,降低被膜厚度,其与胞外多糖分泌和运动性下降密切相关,且能降低假单胞菌酶蛋白酶活性。本研究为有机酸应用于生鲜食品的贮藏保鲜提供了依据,对延缓食品腐败及保证食品安全具有重要意义。后续研究将进一步探究有机酸对假单胞菌sigma因子和群体感应的调控机制。