油菜素甾醇对沟叶结缕草长期培养愈伤组织生长和再生的影响

林恬逸 周 认 柴明良

(浙江大学农业与生物技术学院园艺系,浙江杭州 310058)

胚性愈伤组织是禾本科植物分子育种的重要材料,应用体细胞无性系变异技术是暖季型草坪草改良的有效途径。利用愈伤组织进行突变体筛选的前提条件是建立长期维持再生频率高的细胞培养系。在结缕草(Zoysia.japonicaSieb.et Zucc.)的研究中只有形态特征为黄色、紧实、非常疏松的愈伤组织类型才具有较高的再生频率[1]。从长期维持的愈伤组织培养体系中获得高频率再生能力的愈伤组织具有重要的价值,能高效、持续、经济地为植物生物技术研究提供材料[2-5]。

沟叶结缕草[Zoysiamatrella(L.)Merr.],又名马尼拉草,为禾本科多年生暖季型草坪草,是我国自然分布的5个结缕草属草种之一[6]。由于其具有质地细密、坪观质量好、生长势强、绿期长、传播快、耐盐、耐荫性强和养分需求低等优点[7],在我国海南、广东、台湾等热带地区及长江以南等亚热带地区广泛应用。沟叶结缕草主要通过根状茎和匍匐茎进行营养繁殖,相较于传统的杂交育种,沟叶结缕草主要利用体细胞无性系变异和基因工程等新的生物技术手段进行品种的选育[8]。尽管部分研究对结缕草属植物离体培养和再生进行了报道[9-11],但利用营养器官诱导愈伤组织难度大、周期长,诱导获得胚性愈伤组织效率低,在实际研究中培养具有高再生能力的可快速生长的结缕草胚性愈伤组织仍存在较大的困难[12]。经过多年的研究,浙江大学观赏植物组织培养实验室建立了一套高效的沟叶结缕草愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分离及长期维持胚性愈伤组织的方法[13],为沟叶结缕草生物育种奠定了基础。但研究发现,愈伤组织的长期继代培养通常会导致其再生能力降低[14],而转基因玉米(Zea maysLinn.)抗性愈伤组织再生的研究中发现,继代4次时,分化率从80%降至20%[15];在芜萍[Wolffia arrhiza(L.)Horkelexwimm]愈伤组织诱导中,利用二步法愈伤组织离体培养仅能维持约一年的时间[16];小麦(TriticumaestivumL.)幼胚愈伤组织随着诱导和继代间隔时间的延长,愈伤组织分化率迅速下降[17]。随着培养时间的延长,继代次数的增加,沟叶结缕草的胚性愈伤组织的再生率呈现下降趋势,继代6年、8年、10年的愈伤组织再生率约分别为80%、70%和40%[18-20]。在植物组织培养过程中,植物生长调节剂对促进离体植物组织的生长具有很好的效果[21],因此利用植物生长调节剂不断优化完善长期离体的愈伤组织培养体系,对维持其高效的再生能力具有重要的意义。因此,许多研究通过添加不同浓度生长素[2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)]、脱落酸(abscisic acid,ABA)、酪蛋白氨基酸、脯氨酸、山梨醇和甘露醇等植物生长调节剂和添加剂,恢复并提高长期培养的禾本科植物如小米[Eleusine coracana(L.)Gaertn][22]、柳枝稷(PanicumvirgatumL.)[23]、玉米[24]等和其他具有经济效益的植物如苜蓿(MedicagosativaL.)[25]、牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)[26]、草莓(FragariaananassaDuch.)[27]、火龙果(HylocereusundatusBritt.)[28]等植物愈伤组织的再生能力,以此建立愈伤组织长期维持并高效再生的培养体系。

油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)是一种调节植物发育和生理过程的类固醇激素,在细胞分裂、植物茎和根的伸长、光形态建成、生殖发育、叶片衰老、胁迫响应等方面有着重要作用[29]。目前,生长素[如2,4-D、IAA、NAA、吲哚丁酸(indole-3-butytric acid,IBA)等]和细胞分裂素[如6-苄基腺漂呤(6-benzyladenine,BA)、噻苯隆(thidiazuron,TDZ)、激动素(kinetin,KIN)、玉米素(zeatin,ZEA)等]是植物组织培养应用中最主要的两类生长调节剂[30]。在前期对沟叶结缕草离体培养和再生体系构建和优化的过程中发现,生长素和细胞分裂素对促进愈伤组织生长和提高再生效率起到了关键作用[26,31]。而BR作为一类重要的植物激素,在植物组织培养和体细胞无性系变异中也发挥着重要功能。油菜素内酯(brassinolide,BL)、高油菜素内酯(homobrassinolide,HBL)和表油菜素内酯(epibrassinolide,EBL)是植物生理研究中应用最广泛的3种油菜素甾醇类物质[32]。研究表明,外源BL能促进针叶树和水稻(OryzasativaL.)的胚性组织的形成[33],促进甘蔗(Saccharumspp.)嫩芽的离体培养并提高其驯化成活率[34],促进花椰菜(Brassicaoleraceavar.boturytis L.)下胚轴不定芽再生[35],促进狐米草(Spartinapatens)[36]愈伤组织增殖、生长和再生。外源施用EBL能促进高丛蓝莓(VacciniumcorymbosumL.Brigitta blue)[37]再生,对小麦[38]、水稻[39]愈伤组织细胞伸长和分裂也具有明显的促进作用。

目前,BR对植物组织培养的研究主要集中在其对愈伤组织生长和再生的作用上,对BR参与愈伤组织生长和再生过程的生理变化及其对抗氧化系统的影响研究较少。因此,本研究以EBL为外源植物生长调节物质,探究不同浓度EBL对沟叶结缕草愈伤组织生长和再生的影响,研究其对抗氧化系统的作用机理,旨在选出最优EBL浓度,提高长期离体培养的愈伤组织生长及再生的效率,为优化沟叶结缕草继代和再生体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为沟叶结缕草匍匐茎诱导的胚性愈伤组织,在浙江大学观赏植物组培实验室中继代培养15年。以MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.15 g·L-1脯氨酸+40 g·L-1蔗糖+3.0 g·L-1植物凝胶(Phytagel)为继代培养基,每4周继代培养1次。

1.2 试验方法

1.2.1 EBL对愈伤组织继代生长的影响 以上述继代培养基为基本培养基,分别添加不同浓度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50μmol·L-1)的EBL,以0 μmol·L-1EBL为对照。调节pH值至5.8,培养基在121℃下灭菌20 min,备用。选取直径约3 mm旺盛生长的淡黄色颗粒状的致密胚性愈伤组织作为外植体,每皿接种20(5×4)块,称量初始鲜重,每个浓度梯度设置5个生物学重复。在25±2℃的培养室暗培养4周后测定胚性愈伤组织的直径(mm)和鲜重(g),计算直径增长率、鲜重增长率,观察记录愈伤组织生长情况并统计褐化率[39]:

1.2.2 EBL对愈伤组织再生的影响 以再生培养基1/2MS+30 g·L-1蔗糖+3.0 g·L-1Phytagel为基本培养基,分别添加不同浓度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μmol·L-1)的EBL,以0 μmol·L-1EBL为对照,调节pH值至5.8,培养基在121℃下灭菌20 min,备用。愈伤组织在继代培养基预培养2周后,选取直径3 mm大小均匀、生长旺盛的愈伤组织,接种至再生培养瓶中,每瓶接种16(4×4)块,每个浓度梯度设置5个生物学重复。在温度25±2℃,光照16 h·d-1,光强约为40μmol·m-2·s-1的培养室中进行再生。6周后观察记录胚性愈伤组织的根、芽的生长情况,分别统计直径、鲜重增长率、褐化率和再生率:

1.2.3 EBL对愈伤组织继代和再生过程中生理的影响 分别取继代培养4周的愈伤组织和再生培养6周的再生植株叶片0.1 g,每个处理重复3次。取样后置于4℃预冷的研钵中,依次加入3mL 50mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值7.8,0.2 mmol·L-1EDTA,1%PVP)进行研磨,充分研磨后在4℃、12 000 r·min-1条件下离心20 min,回收上清液。用UV-2550型分光光度计(日本SHIMADZU公司)测定抗氧化酶活性等生理指标[40]。由于过氧化氢酶(catalase,CAT)活性在愈伤组织的测定中不稳定,不具备统计学意义,因此继代培养的愈伤组织测定过氧化物酶(peroxidase,POD),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;再生植株叶片测定CAT、POD、SOD活性及MDA含量。CAT活性测定参照Liang等[41]的方法,POD活性测定采用愈创木酚法[42],SOD活性测定采用NBT(氮蓝四唑)光还原法[43],MDA含量采用硫代巴比妥酸法[44]。

1.3 数据统计与分析

试验结果均为3或5次重复的平均值,使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和Duncan’s多重比较(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同浓度EBL对沟叶结缕草愈伤组织生长的影响

沟叶结缕草愈伤组织在含不同浓度的EBL培养基中继代生长4周后,其直径、鲜重(表1)及生长状况(图1)在各处理间存在明显差异。当EBL浓度为0.02μmol·L-1时,愈伤组织的直径达到最大值(6.93 mm),直径增长率为131.11%;当EBL浓度为0.20 μmol·L-1时,愈伤组织鲜重增长量最高,达到1.24 g,鲜重增长率是对照组的2.9倍;EBL浓度为0.50 μmol·L-1时愈伤组织鲜重增长率是对照组的1.7倍。0.20μmol·L-1浓度的EBL对促进愈伤组织鲜重增长明显,但实际生长情况表明,0.20和0.50μmol·L-1EBL处理组的愈伤组织呈现明显的白色水渍状,愈伤组织明显失去胚性(图1-f、g)。而0.01和0.02 μmol·L-1EBL对鲜重的增长也有较好的促进作用,且愈伤组织胚性维持良好,在继代过程中始终保持淡黄色、紧致的颗粒状(图1-c)。从愈伤组织的褐化率来看,当EBL浓度为0.01～0.20μmol·L-1时,愈伤组织褐化率均低于对照,当EBL浓度为0.5μmol·L-1时,愈伤组织的褐化率高达50.0%。综上表明,适宜浓度的EBL能促进愈伤组织的生长,减少褐化发生,保持愈伤胚性和生长活性,0.02μmol·L-1EBL是促进愈伤组织生长的最佳浓度。

2.2 不同浓度EBL对沟叶结缕草愈伤组织再生的影响

不同浓度的EBL处理后,沟叶结缕草愈伤组织再生过程表现出明显差异(表2、图2)。再生6周后,所有浓度处理组的愈伤组织直径增长率与对照组均无显著差异。而从愈伤组织的鲜重增长率和再生率看,0.02μmol·L-1EBL处理组的鲜重增长率和再生率分别达到了对照组的1.1倍和2.1倍。0.05μmol·L-1EBL处理组的鲜重增长率仅次于0.02μmol·L-1EBL处理组,是对照组的1.11倍,但其再生率高于对照(图2-d)。从愈伤组织的褐化程度看,再生培养6周后,0～1.00μmol·L-1EBL浓度处理组均有不同程度褐化,且不同组合之间褐化程度差异不显著,只有在EBL浓度高达2.00μmol·L-1时,愈伤组织出现明显褐化(图2-i)。综合分析,0.02μmol·L-1EBL处理能提升沟叶结缕草再生能力,更好地促进胚性愈伤组织的再生,而EBL浓度过高则抑制愈伤组织的再生。

2.3 不同浓度EBL对沟叶结缕草愈伤组织和再生植株生理的影响

2.3.1 不同浓度EBL对继代过程中愈伤组织生理的影响 不同浓度EBL处理对沟叶结缕草愈伤组织继代过程中POD、SOD活性和MDA含量有不同程度影响,但不同浓度的EBL处理对POD、SOD活性和MDA含量的影响的程度存在差异。由图3-A可知,随着EBL浓度的增加,POD活性表现出先下降后上升再下降的趋势,0.01、0.02、0.05和0.10μmol·L-1处理组POD活性均显著低于对照,说明低浓度EBL抑制POD活性,0.20μmol·L-1EBL处理组POD活性显著高于对照组,是对照组的1.28倍,该浓度EBL处理对沟叶结缕草愈伤组织继代过程中POD的活性具有促进作用。由图3-B可知,当EBL浓度达到0.50μmol·L-1时SOD活性较对照显著降低了76.76%,说明该浓度EBL对SOD活性有抑制作用;其余浓度处理组SOD活性与对照组差异不显著,但整体随EBL浓度增加呈先上升后下降的趋势。由图3-C可知,不同浓度EBL对MDA含量也有较大影响,EBL处理组均显著低于对照组,其中0.02μmol·L-1EBL处理组MDA含量最低,较对照降低了42.78%。

表1 EBL对沟叶结缕草愈伤组织继代生长的影响Table1 Effects of EBL on the growth of embryogenic callus in Z.matrella

表2 EBL对沟叶结缕草愈伤组织再生的影响Table2 Effects of EBL on the growth of embryogenic callus in Z.matrella

综合分析,在愈伤组织生长过程中低浓度的EBL能降低愈伤组织POD活性,EBL高于一定浓度后能显著增加愈伤组织的POD活性,而高浓度的EBL对SOD活性具有抑制作用。EBL处理可降低愈伤组织MDA含量,0.02μmol·L-1EBL作用最强。

2.3.2 不同浓度EBL对再生植株生理的影响 不同浓度EBL处理对沟叶结缕草愈伤组织再生过程中CAT、POD、SOD活性和MDA含量有不同程度影响(图4)。0.20μmol·L-1EBL处理组未获得再生植株,以愈伤组织进行生理测定,与再生植株叶片生理不能在同一水平进行比较,因此在结果分析中不包含此项数据。不同浓度EBL处理组的CAT活性均显著高于对照组,其中1.00μmol·L-1EBL处理组CAT活性最高,是对照组的5.96倍;相对其他浓度处理组,0.05μmol·L-1EBL处理组CAT活性最低,是对照组的3.70倍。POD活性与CAT一样均有不同程度的增加。0.50 μmol·L-1EBL处理组POD活性最高,是对照组的2.11倍。SOD活性则随着EBL浓度增加表现出先上升后下降的趋势,0.10μmol·L-1EBL处理组SOD活性显著高于对照组,其余浓度处理组与对照组差异不显著。因此,不同浓度的EBL可能通过影响不同的抗氧化反应从而对植物再生产生不同影响。再生植株MDA含量变化趋势与愈伤组织基本相同。不同浓度EBL处理组的MDA含量均低于对照组,0.02、0.05和2.00μmol·L-1EBL处理组与对照差异显著,其中0.02μmol·L-1处理组MDA含量最低,比对照降低了30.15%。综合分析表明,EBL对愈伤组织再生过程中CAT、POD、SOD活性具有不同程度的促进作用,表明EBL可通过抗氧化反应体系调控沟叶结缕草愈伤组织再生。

3 讨论

BR是具有广泛生物活性的一类植物激素,研究表明,BR通过与生长素、赤霉素和细胞分裂素等植物激素的协调作用对植物生长进行调控,通过刺激植物的伸长、细胞分裂和维管发育而对植物产生生理影响[45]。在各种生物测定中,油菜素内酯的活性较生长素如IAA或NAA高10～1 000倍,或与生长素协同作用[46-47]。Pullman等[33]研究发现BR刺激体细胞胚胎发生,显著提高了针叶树和水稻的诱导率;Chavan等[34]发现BR可能直接或通过刺激生长素和细胞分裂素来促进甘蔗生长;Sasaki[35]在油菜素内酯增加花椰菜下胚轴不定芽产生的研究中发现,当BR与细胞分裂素同时作用时,再生率显著提高,表明BR在诱导分化过程中的部分作用是增加细胞分裂素的效力。浙江大学观赏植物组培实验室前期研究发现施加适宜浓度的细胞分裂素能促进沟叶结缕草愈伤组织的生长、再生,并加强抗氧化酶的活性。本试验结果表明,0.02 μmol·L-1EBL处理的沟叶结缕草愈伤组织生长及再生能力得到明显提升,因此,BR对沟叶结缕草愈伤组织的生长和再生有显著的促进作用,可能通过与细胞分裂素或生长素等其他激素途径的协同作用从而影响其生长和再生。而0.02μmol·L-1EBL处理在试验期内未观察到肉眼可见的再生芽,可能由于经过长期继代培养的愈伤组织通常再生能力下降,同时形成再生植株需要的时间较长。虽存在上述愈伤组织的特性及肉眼观察带来的误差,但EBL处理的总体趋势是低浓度EBL促进愈伤组织再生,高浓度EBL的促进作用下降。

植物体在长期的进化过程中形成了一套抗氧化酶系统来清除体内的活性氧(reactive oxygen species,ROS),维持植物体内正常的新陈代谢,植物体内抗氧化系统主要由CAT、POD和SOD等组成。虽然促进ROS氧化还原调节植物生长和胁迫耐受性的确切机制仍有待阐明,但是越来越多的证据支持ROS是激素信号传导中至关重要的第二信使,该信号可协调调节植物的发育和胁迫耐受性[48]。研究表明BR能诱导ROS的产生。因此,外源EBL的作用能够刺激愈伤组织中ROS产生,从而激活植物体内抗氧化酶活性。这与本研究EBL处理再生过程中抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性增强的结果一致。多项研究也表明,植物体细胞胚胎发生过程与抗氧化酶系统有直接的联系,SOD活性升高对早期胚胎发育和胚性细胞分化具有促进作用,随着体细胞胚胎发生的进程,SOD活性表现出先上升后下降并趋于稳定的现象,而较低水平的POD活性有利于细胞的分裂和增殖,当胚性细胞大量形成后,POD活性升高[49-51]。本研究中,继代过程各EBL处理组POD活性降低,SOD活性无显著变化,但在较低浓度EBL处理下整体呈上升趋势,有利于愈伤组织细胞分裂和增殖,再生过程中EBL处理组CAT、POD、SOD活性均升高,有效促进了沟叶结缕草胚性细胞的分化和再生。而SOD活性升高但差异不显著,可能是由于再生6周后,细胞生长进入适应期,SOD活性逐渐趋于稳定。

MDA是膜脂过氧化的最终分解产物,其含量是反映细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标,激活抗氧化系统有助于植物去除体内过量的ROS和抑制脂质过氧化[52]。本研究中,EBL处理沟叶结缕草愈伤组织继代和再生过程MDA含量均降低,可能是由于EBL通过BR途径激活了植物体内的抗氧化系统,抑制脂质过氧化反应发生,从而抑制了MDA的产生和积累。在继代和再生过程中,0.02μmol·L-1EBL处理组MDA含量最低,说明该浓度下EBL对抗氧化系统活性作用最强。本研究为探究BR调控沟叶结缕草体细胞胚胎发生过程中生理机制和分子机理提供基础资料,为进一步优化沟叶结缕草组织培养体系及对沟叶结缕草愈伤组织生长与再生过程中关键酶及其相关的基因研究提供了理论依据。

4 结论

本研究结果表明,BR对沟叶结缕草愈伤组织的生长和再生有明显的促进作用,0.02μmol·L-1EBL显著提升愈伤组织的再生率,可用于改善体细胞无性系变异的扩繁体系,具有广泛的应用前景。同时,EBL可能通过BR及其他相关激素途径激活愈伤组织的抗氧化系统的响应,加强继代和再生过程中的抗氧化反应,从而调控体细胞胚胎发生过程中的生理生化进程。