基于TGF-β1/Smad3通路和AGEs/RAGE分子研究丹蛭降糖胶囊干预糖尿病大鼠心肌纤维化的作用

汪四海,方朝晖，储 俊，倪英群，赵进东，姜 辉，霍星星，方 舟，毕 正

(1. 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2. 安徽省中医药科学院中医药防治糖尿病研究所，安徽 合肥 230031；3. 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038；4. 安徽中医药大学，安徽 合肥 230038)

随着社会的发展和经济水平的提高，糖尿病的患病率逐年增高，严重威胁着人类身心健康。流行病学研究发现，糖尿病患者70%以上死于心血管系统疾病，是非糖尿病人群心血管系统疾病病死率的2～3倍[1]。糖尿病心肌病作为糖尿病的心血管并发症之一，发病率高，危害性大，与糖尿病患者心血管疾病的高发病率和高病死率密切相关，因此成为近年来基础与临床研究的热点。心肌纤维化是糖尿病心肌病的主要病理改变[2]，而心肌纤维化与转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad3信号通路密切相关[3]，当人为敲除TGF-β1基因时，心肌纤维化进程受到显著抑制[4]。相关实验研究证实，2型糖尿病模型大鼠心肌晚期糖基化终末产物(AGEs)/AGEs受体(RAGE)和结缔组织生长因子(CTGF)水平与心肌纤维化存在着正相关性[5-6]。郑书国等[7]实验研究表明，丹蛭降糖胶囊能显著抑制糖尿病血糖波动模型大鼠心肌纤维化，其机制与增强心肌组织抗氧化能力、抑制心肌局部RAS激活及TGF-β1/Smad3信号通路活化、调控MMP-2/TIMP-2蛋白表达水平有关。本团队前期研究发现，丹蛭降糖胶囊可有效防治糖尿病模型大鼠诱导的心肌损伤，其机制可能是抑制高糖诱导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路过度表达[8]。本研究基于TGF-β1/Smad3通路和AGEs/RAGE分子研究了丹蛭降糖胶囊对糖尿病模型大鼠心肌纤维化的影响，进一步探讨该药作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 选鼠龄为10周、体质量180～220 g雄性清洁级SD大鼠48只，购于安徽医科大学实验动物中心，许可证编号：SCXK-(皖)2018-002。安徽医科大学动物房饲养，保持温度22～25 ℃，相对湿度45%～60%，每天黑暗和光照交替12 h。本实验经过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查批准[AHUCM(rats)2018009]。

1.2药物 丹蛭降糖胶囊，安徽中医药大学第一附属医院院内制剂(皖药制字 Z20090006，专利号ZL200310112845.1，0.4 g/粒，批号：20181108)，由太子参、丹皮、生地黄、泽泻、菟丝子、水蛭组成；盐酸二甲双胍片(上海信谊天平药业有限公司，国药准字H31020246，0.25 g/片，批号：67190903)。

1.3试剂与仪器 链脲佐菌素溶液(STZ，Sigma)；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(Zs-BIO)；Revert AidTM first Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(Novoprotein)；AGEs、CTGF和RAGE试剂盒(美国Raybiotech公司)；RT-6000酶标仪(雷杜公司)；DNP-9052BS-III电热恒温箱(上海三发公司)；LX300低速离心机(江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；JW3021HR台式高速离心机(安徽嘉文公司)；StepOne TM荧光定量PCR仪(Thermo Scientific)；TS-1000水平摇床(江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；JS-1070P自动曝光仪(上海培清科技有限公司)。

1.4分组、模型制备及干预 将48只SD大鼠适应性喂养1周，随机选取10只作为空白组，其余38只大鼠连续3 d腹腔注射STZ溶液35 mg/kg，3 d后尾静脉法测随机血糖≥16.7 mmol/L即为糖尿病模型造模成功。根据文献[9]研究，继续饲养6周，见大鼠心脏组织凸显出心肌纤维化的病理改变后，将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、丹蛭降糖组，每组10只。参照《药理实验方法学》[10]中人与大鼠剂量换算方法，二甲双胍组给予二甲双胍150 mg/(kg·d)灌胃，丹蛭降糖组予以丹蛭降糖胶囊按成人6 g/d的等效剂量540 mg/(kg·d)灌胃，空白组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，均连续灌胃8周。

1.5检测指标及方法 灌胃结束后，用3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉各组大鼠，取心肌组织备用。

1.5.1心肌组织病理学观察 取心脏组织，于4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片(厚度为4 μm)，伊红-苏木素复染，梯度脱水后二甲苯通透，中性树脂胶封片，光学显微镜下观察心肌的形态学改变。

1.5.2心肌组织中AGEs、CTGF及RAGE表达检测 分离出左心室心肌组织约100 mg，与10倍量的磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7.4)充分匀浆，收集匀浆上清产物，根据ELISA试剂盒厂家说明书以分光光度计法测定AGEs、CTGF、RAGE表达水平。

1.5.3心肌组织中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达检测 采用Western blot法检测：每组取心肌组织100 mg，加入RIPA细胞裂解液1 mL(每1 mL RIPA包含1 μL蛋白酶抑制剂和4 μL磷酸酶抑制剂)，离心后提取蛋白；上样后，恒流转膜(TGF-β1转膜55 min，Smad3转膜50 min，p-Smad3转膜50 min)；转膜结束后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；参考一抗的说明书：TGF-β1、Smad3和p-Smad3抗体属性为兔抗按照1∶1 000稀释(10%分离胶)，4 ℃缓慢摇动孵育过夜；洗3次，参考二抗的说明书，按照1∶10 000用二抗稀释液稀释过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h；最后用JS-1070P自动曝光仪来检测TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达情况。

1.5.4心肌组织中TGF-β1、Smad3基因表达检测采用实时荧光定量PCR法检测，每组取心肌组织100 mg，液氮研磨成粉末加入1 mL Trizol，冰浴匀浆，提取RNA并测量其浓度和纯度；每组取质量为1 μg RNA反转录成cDNA；以β-actin为内参，按照实验指导书进行基因表达水平的检测。引物TGF-β1序列:正义5’-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3’，反义5’-ACTGAAGCGAAAGCCCTGTA-3’，扩增片段长度为96 bp；引物Smad3序列：正义5’-CTTGGTGCAGAGACCTGTCA-3’，反义5’-TTCTCTGTGATTGCCACTGC-3’，扩增片段长度为74 bp。PCR的反应条件：预变性温度95 ℃，时间60 s；变性温度为95 ℃，时间20 s，退火温度为60 ℃，时间60 s，40个循环。分析方法为Relative Quantification Study，计算方法为2-ΔΔCT。

2 结 果

2.1各组大鼠心肌组织形态 HE染色光镜下观察，空白组大鼠心肌纤维走行正常，排列有序，胞浆鲜红丰富，胞核卵圆形，位于细胞中央；模型组大鼠心肌纤维走行较为紊乱，部分溶解，断裂，胞核位置不一，细胞间界限不清，间质出现纤维细胞增生；与模型组比较，二甲双胍组和丹蛭降糖组心肌细胞的病变明显减轻。见图1～4。

2.2各组大鼠心肌组织中AGEs、RAGE、CTGF表达水平 与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中AGEs、RAGE、CTGF表达水平均显著升高(P均<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和丹蛭降糖组大鼠心肌组织中AGEs、RAGE、CTGF表达水平均显著下降(P均<0.05)，且丹蛭降糖组均显著低于二甲双胍组(P均<0.05 )。见表1。

图1 空白组心肌组织HE染色表现(×400)

图2 模型组心肌组织HE染色表现(×400)

图3 二甲双胍组心肌组织HE染色表现(×400)

图4 丹蛭降糖组心肌组织HE染色表现(×400)

表1 各组大鼠心肌组织中AGEs、RAGE和CTGF水平比较

2.3各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达水平 与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达水平均显著上调(P均<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和丹蛭降糖组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达水平均显著下调(P均<0.05)，且丹蛭降糖组均显著低于二甲双胍组(P均<0.05 )。见图5及表2。

图5 各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达情况

表2 各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达水平比较

2.4各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3基因表达水平 与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3基因表达水平均显著上调(P均<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和丹蛭降糖组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3基因表达水平均显著下调(P均<0.05)，且丹蛭降糖组均显著低于二甲双胍组(P均<0.05 )。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3基因表达水平比较

3 讨 论

糖尿病心肌病属于一种不依赖于高血压病、扩张型心肌病、心脏瓣膜病、冠状动脉疾病及其他已知心脏疾病的独特的心肌病理状态，是在糖脂代谢紊乱及微血管病变基础上诱发的心肌损伤和心肌纤维化，出现左心室肥厚、舒缩功能障碍，并最终导致心力衰竭[11-12]。心肌纤维化是糖尿病心肌病的主要病理改变，也是发展为终末期心脏病的必然过程，同时也是糖尿病患者死亡的主要原因。

糖尿病心肌病及由此引发的心肌纤维化尚缺乏特效治疗药物，目前西医治疗以控制血糖、降脂降压、改善心肌供血为主，长期服用药物引起的不良反应众多，患者依从性较差。糖尿病心肌病属于中医学“消渴病心病”的范畴，多呈现本虚标实之候，本虚多为气阴亏虚，标实多为痰浊、瘀血[13-14]。《灵枢·邪气脏腑病形篇》云：“心脉微小为消瘅。”脾居中焦，为气机升降之枢纽，脾气虚弱，气机升降失调或血液生化不足均可导致血瘀；津亏血少，血行不畅或艰涩亦可致血瘀；气为血之帅，气虚运血无力，也可致瘀。瘀血阻滞胸中，进而出现心悸、胸痛。张会超等[15]实验研究发现，具有益气活血功效的抗纤益心方能够抑制糖尿病大鼠心肌纤维化，改善心功能。石锐等[16]发现具有豁痰解毒、化瘀通络作用的豁痰解毒通络饮能有效改善糖尿病心肌病患者心功能，抑制心室重构，可能是通过调节游离脂肪酸、抑制炎症反应、缓解氧化应激失衡实现的。本课题组前期研究发现，益气养阴、活血通络之丹蛭降糖胶囊可以有效促进糖尿病心肌病大鼠血管新生[17]。

目前，TGF-β1及其下游信号分子Smad3被公认为是糖尿病心肌纤维化的关键调控因素[18-19]。心肌成纤维细胞主要对心肌细胞起结构支持作用并负责细胞外基质的合成，除了产生细胞外基质外，还可分泌多种生长因子以介导其与心肌细胞之间的相互作用并影响后者的功能，当心肌损伤时能产生旁分泌生长因子，如TGF-β1[20]、CTGF[21]。糖尿病心肌病存在着心肌组织中TGFβ1的异常升高，并且与心肌扩张程度呈正相关[22-23]。TGFβ1通过下调细胞外基质(ECM)中的金属蛋白酶(MMPs)活性，增加基质蛋白酶组织抑制物(TIMMPs)的合成，抑制基质降解，导致心肌纤维化，因此阻断TGF-β1信号通路可以延缓心肌纤维化的进程[24]。Smads是TGF-β下游的主要效应蛋白，当 TGF-β受体被激活时，磷酸化的Smad2和Smad3可与Smad4结合，形成复合体转移入细胞核，调控下游基因转录，其中Smad3是大家公认的介导TGF-β1诱导心、脑、肺、肝、肾等脏器纤维化的信号分子，可直接结合胶原的启动子区域，参与ECM的生成和降解[25-29]。生理状态下，CTGF在人类的多种组织器官中广泛表达 ；病理状态下，CTGF可以刺激成纤维细胞的分裂增殖，促进胶原合成，促使心肌发生纤维化，它作为TGF-β1/Smad信号通路的下游因子，可在TGF-β1诱导下加重心室重构[30-31]。AGEs是非酶糖基化反应的终末产物，长期高糖条件下，AGEs快速形成并大量累积，因此RAGE与AGEs结合增多或活性增强，可以诱导NF-κB的活化，并由胞质转移到胞核中，启动多种靶基因的转录，引起一系列炎性因子上调，诱发血管内皮损伤，最终导致动脉粥样硬化[32]。邱惠等[33]研究表明，糖尿病继发的急性ST段抬高型心肌梗死患者直接接受经皮冠状动脉介入治疗后血清 AGEs水平明显升高，且其与心肌损伤标志物CK-MB峰值和NT-proBNP呈正相关，很可能成为该病患者新的影响预后的生物标志物。另外实验研究发现，2型糖尿病大鼠出现心功能改变、心肌肥大和心肌纤维化机制可能与心肌组织AGEs/RAGE轴及CTGF表达增强有关[5-6，34]，故通过观察心肌AGEs/RAGE及CTGF表达水平能够很好地反映心肌纤维化程度和预后。

本实验结果显示，模型组大鼠心肌纤维走行较为紊乱，部分溶解、断裂，胞核位置不一，细胞间界限不清，间质出现纤维细胞增生；而采用二甲双胍以及丹蛭降糖胶囊干预后，心肌组织形态学均有明显改善，说明二甲双胍和丹蛭降糖胶囊均对糖尿病大鼠心肌纤维化有一定防治作用。从左心室AGEs/RAGE分子角度来看，模型组大鼠心肌组织中AGEs、RAGE、CTGF表达水平显著升高，而二甲双胍组和丹蛭降糖组大鼠心肌组织中AGEs、RAGE、CTGF表达水平显著低于模型组，且丹蛭降糖组显著低于二甲双胍组，说明丹蛭降糖胶囊能够通过抑制糖尿病大鼠心肌AGEs/RAGE分子，从而减轻心肌纤维化；从TGF-β1/Smad3信号通路指标来看，模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达水平和TGF-β1、Smad3基因表达水平均显著上调，而二甲双胍组和丹蛭降糖组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达水平和TGF-β1、Smad3基因表达水平均显著低于模型组，且丹蛭降糖组均显著低于二甲双胍组，说明丹蛭降糖胶囊干预TGF-β1/Smad3信号通路的作用明显，结果与心脏形态学变化吻合。

综上所述， 丹蛭降糖胶囊可以延缓糖尿病大鼠心肌纤维化进程，有心脏保护作用，且效果优于二甲双胍，其作用机制可能与抑制心肌TGF-β1/Smad3信号通路和AGEs/RAGE分子表达有关，这为中医药干预糖尿病心肌病提供了新的防治思路和实验根据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。