反相高效液相色谱法测定人血清中泊沙康唑的浓度

计建军，张 慧，查 丽，费爱丽，王小琴，蔡继明，徐少毅，王长江（.嘉兴学院附属第二医院药学部，浙江 嘉兴 34000；.嘉兴学院附属第二医院重症医学科，浙江 嘉兴 34000）

泊沙康唑是新一代三唑类广谱抗真菌药物，抗真菌谱比氟康唑、伊曲康唑更广，不良反应发生率比伏立康唑更低[1]。除了对曲霉菌和念珠菌有效外，对接合菌和毛霉菌也有作用[2-3]。泊沙康唑是亲脂性药物，口服剂型有缓释片和混悬液两种[4]，口服生物利用度变异大，在人体内呈非线性药代动力学过程，不同人的血药浓度差异大，提示临床进行血药浓度监测的必要性[5-6]。泊沙康唑是肝微粒体酶CYP3A4抑制剂，会与体内多种药物产生相互作用，干扰彼此的代谢[7]。目前泊沙康唑的药物浓度检测方法有高效液相色谱法、高效液相-质谱/质谱联用法等[8-9]。由于多数检测方法繁琐复杂，且仪器设备比较昂贵，检测费用也相对较高，本研究通过改进文献中的方法，建立一种简便、快速、准确的泊沙康唑血药浓度测定方法，为临床个体化给药提供依据，确保患者用药安全。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），AL204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），SC-2546台式低速离心机（上海医疗器械有限公司），XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂），W201B恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）。

1.2 试剂

泊沙康唑对照品（东京化成工业株式会社， 批号：P2477，液相用，纯度98%），阿普唑仑对照品（中国药品生物制品检定所，批号171218-200603），甲醇、乙腈为色谱纯（MERCK公司），重蒸水（自制）。

2 方法与结果

图1 HPLC色谱图A-空白血清，B-对照品血清，C-患者血清；1-阿普唑仑，2 -泊沙康唑Fig 1 HPLC chromatogramA-blank serum，B-reference serum，C-patient serum; 1 -alprazolam, 2-posaconazole

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18保护柱（4 mm×4 mm，5 μm），流动相为乙腈∶水 = 60∶40，检测波长为262 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量20 μL。

2.2 对照品和内标溶液制备

精密称取泊沙康唑对照品适量，用甲醇溶解并制成泊沙康唑100 μg·mL-1的标准品储备液；精密称取阿普唑仑对照品适量，用甲醇溶解并制成浓度为10 μg·mL-1的内标溶液，置4 ℃冰箱保存。

2.3 血清样品预处理

取内标溶液50 μL，于50 ℃水浴中氮气吹干，加入200 μL待测血清，加800 μL乙腈沉淀蛋白，漩涡混匀5 min，4000 r·min-1离心10 min，取上清液500 μL，于50 ℃水浴中氮气吹干，用流动相100 μL溶解，取20 μL进样。

2.4 方法专属性

分别取空白血清，空白血清加入内标和泊沙康唑对照品溶液，患者血清按照“2.3”项下方法进行预处理，进样得色谱图，内标和泊沙康唑的保留时间分别为4.7 min和9.1 min，两者分离良好，峰形对称，且空白血清对内标和被测药物均无干扰，检测时间可以控制在10 min内，见图1。

2.5 标准曲线的制备

分别取泊沙康唑对照品储备液与空白血清配制成泊沙康唑浓度分别为50.000、10.000、5.000、2.500、1.000、0.500、0.125 μg·mL-1的对照品血清，按“2.3”项下方法处理后进样。以对照品浓度（C）为纵坐标，对照品与内标的峰面积比值（A）为横坐标，进行线性回归，泊沙康唑的回归方程为：C= 0.983 9 A + 0.403 9（r= 0.999 6），线性范围为0.125～50.000 μg·mL-1。

2.6 相对回收率及精密度试验

在同1 d内5个不同时间点与连续5 d相同的时间点，分别取低、中、高（1、5、25 μg·mL-1）三种浓度的泊沙康唑对照品血清，按“2.3”项下方法处理后进样，计算方法回收率和日内、日间精密度，详见表1。

表1 相对回收率和精密度Tab 1 Relative recovery and precision

2.7 绝对回收率试验

分别取低、中、高3种泊沙康唑对照品血清，经“2.3”项下方法处理后测定药物峰面积A1，同时取适量对照品溶液及内标溶液，于50 ℃水浴中氮气吹干，用流动相溶解成相同浓度进样测定药物峰面积A2，A1/A2即得绝对回收率。泊沙康唑的平均绝对回收率为94.58%。

2.8 稳定性试验

取泊沙康唑对照品储备液制备低、中、高3种浓度的对照品血清，于室温放置0、12、24 h后按“2.3”项下方法处理进行测定，考察对照品血清在室温放置24 h的稳定性，测得泊沙康唑的RSD分别为2.54%、1.87%和1.32%，表明血清样品在室温放置24 h基本稳定。将低、中、高3种浓度的对照品血清，于-20 ℃冰箱冷冻储存，放置0、5、10 d后解冻测定，考察血清样品在冻融后的稳定性，泊沙康唑的RSD分别为2.61%、2.74%、1.95%，表明泊沙康唑对照品血清在-20 ℃下稳定。

2.9 样品血药浓度检测

取患者血清按“2.3”项下方法处理后进样分析，得泊沙康唑峰面积为45.46，内标峰面积为60.32，用已建立的标准曲线计算样品中泊沙康唑的含量，计算得该患者的泊沙康唑血药浓度为1.18 μg·mL-1。

3 讨论

3.1 检测方法

三唑类抗真菌药物在临床使用广泛，可与体内P-450蛋白血红素辅基Fe原子配位结合，具有一定的肝、肾毒性[10]。有研究[11]表明泊沙康唑的临床疗效和不良反应与血药浓度显著相关，对其进行血药浓度监测很有必要。目前国内外已发表的文献[8-9]有采用高效液相-质谱/质谱联用的方法检测泊沙康唑的血药浓度，仪器设备比较昂贵，检测费用也相对较高，基层医院一般不具备这样的条件，也不利于治疗药物监测在基层医院的推广。对于基层医院来说，采用高效液相色谱法经济适用，更适用于泊沙康唑血药浓度的常规检测。

3.2 生物样品预处理

去蛋白处理是生物样品处理的常规预处理方法，由于血液标本含有大量的蛋白质，而蛋白质在测定过程中能形成泡沫、浑浊或沉淀，如果直接进样，蛋白质会逐渐沉积在色谱柱上，不仅影响柱效，还会使色谱柱逐渐阻塞，导致柱压上升，最终无法使用，所以常规要去蛋白处理。常用的去蛋白处理方法有沉淀法和提取法。本研究曾尝试有机溶剂提取法，采用氯仿、氯仿和乙酸乙酯等比例混合等提取血清中药物，但因为操作步骤较多，且回收率低，杂质峰多，最终未采用。有文献[12]报道采用高氯酸酸化后，加入甲醇沉淀蛋白，本研究为了简化步骤直接采用乙腈沉淀蛋白，较为简便快捷，便于氮气吹干浓缩纯化，峰型较好，杂质峰无干扰。

3.3 血药浓度范围

英国医学真菌学会发布的《抗真菌治疗药物监测指南》[13]推荐泊沙康唑的预防和治疗有效浓度分别为＞ 0.7 μg·mL-1和＞ 1.0 μg·mL-1。有文献[14]报道了1548份血标本泊沙康唑的平均浓度为0.64 μg·mL-1，只有18.90%的标本浓度大于1.25 μg·mL-1，最高浓度为6.57 μg·mL-1，检测方法的最低定量下限为0.125 μg·mL-1。本研究建立的方法，泊沙康唑的检测线性范围为0.125～50.000 μg·mL-1，最低定量限与文献报道相同，而最高检测浓度达到50 μg·mL-1，完全能满足临床患者的检测需要。通过治疗药物监测，临床可以及时调整药物用量，改善疗效，减少不良反应的发生，保障患者的用药安全有效。