榄香烯乳对小鼠全脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

赵丽英，郑 蓓（.德清县人民医院临床药学室，浙江 湖州 3300；.浙江省立同德医院临床药学室，浙江 杭州 300）

缺血性脑血管病是临床常见病、多发病，致残致死率极高[1]，因此研发新型抗脑缺血性药物具有重要的临床意义。榄香烯是从姜科植物莪术的挥发油中提取出来的抗癌有效成分，具有行气破血的功效，目前榄香烯已在临床上应用并取得较好疗效[2]，但其机制尚未阐明。研究[3]表明在大鼠脑缺血模型中，榄香烯乳可降低脑内炎症因子水平并具有一定的脑损伤保护作用。脑缺血/再灌注损伤是多种机制参与的一种复杂病理生理过程，主要与自由基过度形成、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎性反应等多种机制有关，这些因素互为因果，最终导致神经元损伤[4]。本研究采用小鼠全脑缺血模型，研究榄香烯乳对其神经保护作用及相关机制，以期为缺血性脑血管病的病理机制及治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠，雄性，体质量22～25 g，购自浙江省医学科学院动物中心，动物合格证号：SCXK（浙）2014-0001。动物实验在浙江省医学科学院动物中心屏障环境完成，动物使用许可证：SYXK（浙）2014-0008。小鼠均可自由进食、饮水；室温控制在（22±3）℃，日温差≤ 3 ℃，相对湿度40%～70%。18只小鼠随机分为假手术组、模型组和榄香烯乳组，每组6只。榄香烯乳组分别于术前和术后30 min腹腔注射榄香烯乳10 mg·kg-1，榄香烯乳用生理盐水稀释，每只小鼠注射0.2 mL；假手术组和模型组注射等体积的生理盐水。

1.2 主要试剂与仪器

榄香烯乳注射液购自大连金港制药有限公司（规格0.1 g∶20 mL）；苏木素-伊红染色（HE）试剂由浙江省医学科学院实验室配置；4%多聚甲醛（上海酶联生物科技有限公司，批号：190203）；TUNEL试剂盒（美国Roche公司）；IL-1βELISA试剂盒，IL-6 ELISA试剂盒和TNF-αELISA试剂盒（加拿大Anogen公司）；多功能酶标仪（型号：Enpire，美国Perkin Elmer公司），显微镜（型号：BX51，日本Olympus公司）。

1.3 全脑缺血再灌注模型的制备

小鼠于术前12 h禁食不禁水，用10%水合氯醛（400 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，颈正中切口剪开筋膜，暴露双侧颈总动脉，用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭10 min后松开动脉夹，恢复脑部供血，缝合切口，术后置于温床观察，提供充足食物和水。术中动物死亡3只，死亡率为20%。假手术组除不夹闭颈总动脉外，其余操作同模型组。术后小鼠进行神经症状评分，1～4分为有效模型。

1.4 神经症状和神经功能评分

术后24 h观察各组动物的神经症状和功能，参照文献中的方法[5]。神经症状评分等级分五级：0分为无症状，1分为背部弓起，2分为强直性癫痫发作，3分为上睑下垂，4分为无意识。神经功能评分：1）平衡木测试：将小鼠置于直径为2.0 cm的平衡木上，小鼠保持的时间至少30 s记为3分；2）抓握牵引测试：小鼠置于直径为1.0 cm的悬空尼龙绳上，在绳上停留的时间至少5 s记为3分；3）网格测试：将小鼠置于一个面积为20 cm×40 cm的网格板上，平板快速从水平转为垂直过程中小鼠在网格的停留时间至少15 s记为3分。将三项测试记分之和作为小鼠的神经功能评分。

1.5 组织样本制备

小鼠行为学评分后，摘取眼球采血方式致死。分离血清，分装冻存于- 80 ℃冰箱，用于测定炎症因子的含量。小鼠取血后快速断头取脑，用4%多聚甲醛缓冲液室温固定48 h，用于组织病理学检查及免疫组化实验。

1.6 脑组织病理组织学检查

多聚甲醛固定后的脑组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、烤箱内浸蜡，石蜡包埋处理后，在AO切片机上连续切片，厚度为10 μm，每间隔5片取1片用于实验。切片浸润30%乙醇后放入水浴箱中展平，粘贴于载玻片上，常规HE染色、封片，光镜下观察、拍照，并计算神经元密度。

1.7 TUNEL染色检测神经元凋亡

样本石蜡切片后，按TUNEL试剂盒说明书进行操作，将切片置于光镜下观察并拍照，若细胞核染为棕黄色即为TUNEL阳性细胞，统计TUNEL阳性细胞数，计算神经元凋亡率（%）=（TUNEL阳性细胞数/假手术组平均TUNEL阳性细胞数）×100。

1.8 ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α浓度

将各组收集好的血清置于冰上冻融，用于检测IL-1β、IL-6和TNF-α浓度，操作方法参照ELISA试剂盒说明书执行，在450 nm处测定样本吸光度。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠神经症状和神经功能评分

假手术组术后24 h无明显神经症状；与假手术组比较，模型组神经症状评分明显增高（P＜ 0.001），83.33%小鼠发生癫痫，部分伴有上睑下垂；而榄香烯乳组与模型组相比，术后24 h神经症状评分明显降低（P＜ 0.05），见表1。与假手术组比较，模型组术后24 h神经功能评分较高（P＜ 0.001），榄香烯乳组神经功能评分较模型组有明显改善（P＜ 0.001），见表1。结果提示，榄香烯乳可在一定程度上改善小鼠全脑缺血模型神经功能障碍。

表1 各组小鼠神经症状和神经功能评分Tab 1 Neurological symptoms and neurological function scores of mice in each group

2.2 小鼠脑组织病理结构改变

HE染色结果表明，假手术组无明显神经元细胞损伤；与假手术组相比，模型组神经元受损，核固缩明显，着色加深，并且皮层神经元密度降低了56.9%（P＜0.001）；榄香烯乳组与模型组相比，神经元损伤，核固缩和神经元染色均明显减轻，皮层神经元密度提高了31.1%（P＜ 0.001），见表2。结果提示，榄香烯乳可减轻小鼠全脑缺血再灌注诱导的大脑皮层神经元损伤。

2.3 小鼠大脑皮层神经元细胞凋亡情况

与假手术组比较，模型组大脑皮层TUNEL阳性细胞数明显增多，凋亡率为267.6% （P＜ 0.001）；与模型组比较，榄香烯乳组明显减少皮层TUNEL阳性细胞数（P＜ 0.001），减少了110.8%，见表3。结果提示，榄香烯乳可减少小鼠全脑缺血再灌注损伤诱导的皮层神经元凋亡。

表3 各组小鼠大脑皮层神经元凋亡率Tab 3 Apoptotic percentage of cortical neuron in mice in each group

2.4 小鼠血清炎症因子水平分布情况

与假手术组比较，模型组炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均显著增高（P＜ 0.001）；与模型组相比，榄香烯乳组显著减少IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平（P＜ 0.001），分别减少了74.3%、48.0%和76.6%。表4结果提示，榄香烯乳可减轻小鼠全脑缺血再灌注损伤诱导的外周炎症水平。

3 讨论

缺血性脑血管病，包括全脑缺血，在临床中较为常见。肺栓塞、溺水、心脏骤停、心肺手术和休克等引起的低血压均可造成脑血流量低灌注和缺血性脑损伤。脑缺血发病率逐年增高，在临床尚无有效的干预手段，因此针对脑缺血再灌注损伤的治疗已成为当今脑血管病研究的一个热点。榄香烯是从中药莪术中提取的有效成分，它是我国自主开发研制的广谱抗癌二类新药，具有降低肿瘤细胞有丝分裂能力，诱发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长[6]。研究[3,7]表明，榄香烯可透过血脑屏障，降低大鼠脑缺血侧纹状体内炎症因子水平，对脑缺血再灌注损伤具有改善作用。本研究采用夹闭小鼠双侧颈总动脉的方法制作全脑缺血再灌注模型，并通过神经症状和神经功能评分证实模型制作成功。从形态学上可以发现，模型组小鼠大脑皮层神经元细胞有明显损伤。本研究发现榄香烯乳对小鼠全脑缺血损伤具有一定的保护作用，可减轻术后24 h小鼠神经功能障碍和皮层神经元损伤。

表4 各组小鼠血清炎症因子水平Tab 4 Serum levels of inflammatory cytokines of mice in each group

脑缺血再灌注损伤的发病机制十分复杂，目前尚不明确。已有研究表明其发病机制可能是神经细胞缺血缺氧，引起过度自噬及炎症反应，而再灌注后加速细胞凋亡、诱发炎症级联反应[8-10]。炎症反应启动后，活化的神经细胞会产生和释放促炎因子，包括TNF-α，IL-6等，从而导致脑缺血过程中神经元细胞的死亡。另外，促炎因子还可诱导黏附分子的表达，这些黏附分子会促进外周免疫细胞如中性粒细胞、单核巨噬细胞的渗透，这通常会导致二次神经元损伤，称为缺血再灌注损伤[11-12]。因此抑制神经元凋亡和神经网络炎症反应是治疗脑缺血再灌注损伤的有效手段。本研究发现全脑缺血再灌注损伤可增加皮层神经元凋亡数量，上调血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平，这与既往研究结果一致[13]，再次证实了凋亡和炎症在脑缺血损伤中发挥着重要作用。榄香烯乳可减少小鼠大脑皮层神经元凋亡，降低外周炎症因子的表达水平。本研究从整体动物水平证实榄香烯乳对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探索其机制涉及抗凋亡和抗炎作用。

综上所述，榄香烯乳可通过减轻皮层神经元凋亡和炎症水平而减轻小鼠全脑缺血再灌注损伤，但其抗凋亡、抗炎涉及的信号通路机制尚不清楚，有待进一步的研究加以阐明。