福建省蛇源裂头蚴的分子鉴定及遗传分析

宋肇程，陈育琪，黄潇航，魏坤亚，张 龙，殷光文，黄志坚

(福建农林大学动物科学学院/福建省动物药物工程实验室，福建福州 350002)

裂头蚴(Sparganum )为曼氏迭宫绦虫裂头蚴，是曼氏迭宫绦虫(Spirometramansoni)中绦期的幼虫，与欧猥迭宫绦虫(Spirometraerinaceieuropaei)同种异名[1]。曼氏迭宫绦虫成虫多寄生于犬、猫等食肉动物的小肠内[2]。裂头蚴一般寄生于蛙、蛇、鸟类或一些哺乳类的肌肉、皮下组织或胸腹腔等处。

裂头蚴在世界分布较广，欧洲、美洲、澳洲及非洲都有报道，但在东南亚国家居多。我国很多省市有过记载，最多见于南方如湖南、广西、广东和福建等[3]。裂头蚴病是一种重要的人兽共患病，该病呈全球性分布[4]。随着人们生活水平不断提高，蛙类、蛇类等特殊食材的需求量也日益增加，这使得其成为了人类感染裂头蚴病的重要途径[5]。裂头蚴通常经外伤伤口或消化道感染人体，可能会寄生于眼部、皮下、内脏、乳房、脊髓和大脑等部位[6-7]。由于其在机体各器官之间移行从而产生机械或化学刺激导致患者出现恶心呕吐、腹部不适、甚至失明等症状，严重时可导致死亡[8-9]。

福建省蛇类寄生虫的遗传分析研究数据较少，本试验对福建省三明市、漳州市及南平市的某蛇场收集到的4条舟山眼镜蛇、7条王锦蛇及5条滑鼠蛇样本进行检查，并从其皮下组织包囊中采集得到裂头蚴虫体进行分子生物学鉴定与遗传分析。内部转录间隔区(internal transcribed spacers，ITS)存在于核糖体基因中，在生物进化过程中表现出种内高度保守，种间有不同程度变异的特性[10]。线粒体基因组是一种细胞核外遗传物质，具有结构简单、母系遗传、缺少重组、进化速率快等特点，是寄生虫遗传学鉴定的理想分子标记[11-12]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAD4)基因是线粒体上进化速率较快的基因[13]；线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅲ亚基(cytochrome C oxidase 3,COX3)基因比较保守，是研究物种分子系统演化和分类的有效基因[14]。本试验对所得到的裂头蚴ITS基因序列、NAD4基因序列以及COX3基因序列进行PCR扩增、测序，并与NCBI数据库中的相应序列进行比较分析，对样品进行分子鉴定和分析，为福建省蛇源裂头蚴的分子鉴定提供科学根据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 采自福建省三明市、漳州市和南平市一些蛇场的舟山眼镜蛇、王锦蛇和滑鼠蛇。

1.2 方法

1.2.1 病原检查 观察受检蛇样本的健康状况，检查其鳞片表皮、皮下组织和肌肉组织是否存在裂头蚴包囊，对获得的裂头蚴样本进行记录并计算感染率。

1.2.2 样本DNA提取及PCR扩增目的片段 将获得的裂头蚴使用FastDNA SPIN Kit试剂盒提取虫体DNA。使用特定引物和扩增酶(表1)进行扩增，扩增酶Transstart Fastpfu super Mix的反应体系为50 μL，反应条件为95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 5min。EasyTaqMix的反应体系为25 μL，反应条件为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。扩增时用超纯水代替样本设阴性对照，扩增结束后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，于紫外成像系统下观察并记录结果。

表1 PCR引物序列和扩增酶

1.2.3 PCR产物纯化与测序分析 使用北京全式金公司胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit，按照操作步骤进行PCR产物纯化。后连接于pEASY -Blunt Simple载体上转化至Trans I-T1感受态细胞中扩增，涂Kana抗性平板培养过夜。在长出菌落的平板上挑取单个菌落于Kana抗性LB培养基中培养5 h～6 h。将培养好的菌液用EasyTaqMix和M13F/M13R引物进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。挑选阳性菌液送至福州铂尚生物工程技术公司测序。将测序结果与NCBI公布的相关裂头蚴基因序列进行比对分析，并使用DNA Star7.1软件对样本基因序列之间进行同源性分析、基因序列碱基成分测定以及突变位点的测定。使用MEGA7软件测定试验样品基因序列的遗传距离，并绘制种系进化树进行分析。

2 结果

2.1 病原检查结果

对获得的4条舟山眼镜蛇、7条王锦蛇及5条滑鼠蛇样本进行检查，发现共5条蛇感染裂头蚴，总感染率为31.25%。分离到裂头蚴样本9条，计算得知感染强度为1.8条/蛇。裂头蚴均寄生在蛇的皮下组织(图1)，分离得到的虫体长度在1 cm～5 cm，呈乳白色，身体扁平柔软，有较强的活动性和收缩性。每种蛇的感染情况见表2。

表2 福建省养殖蛇类的裂头蚴感染情况

图1 分离得到的裂头蚴虫体

2.2 目的基因片段的PCR扩增结果

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳结果，可见ITS基因序列条带大小约1 500 bp，1～9号样品可以明显看出扩增到ITS基因(图2)；NAD4基因序列大小约500 bp，1～9号样品可以明显看出扩增到NAD4基因(图3)；COX3基因序列条带大小约400 bp，1～5号样品可以明显看出扩增到COX3基因(图4)。

M.DNA 标准DL 5 000;1～4.舟山眼镜蛇裂头蚴样品；5～9.王锦蛇裂头蚴样品；10.阴性对照M.DNA Marker DL 5 000;1-4.Sparganum from Naja atra;5-9.Sparganum from Elaphe carinata;10.Negative control

M.DNA 标准DL 5 000;1～4.舟山眼镜蛇裂头蚴样品；5～9.王锦蛇裂头蚴样品；10.阴性对照M.DNA Marker DL 5 000;1-4.Sparganum from Naja atra;5-9.Sparganum from Elaphe carinata;10.Negative control

M.DNA 标准DL 5 000;1～2.舟山眼镜蛇裂头蚴样品；3～5.王锦蛇裂头蚴样品；6.阴性对照M.DNA Marker DL 5 000;1-2.Sparganum from Naja atra;3-5.Sparganum from Elaphe carinata;10.Negative control

2.3 裂头蚴基因序列分析

2.3.1 ITS基因序列分析 本试验使用TW81F/AB28引物扩增出的目的基因序列包括部分18S rRNA基因，全部的ITS-1基因、5.8S rRNA基因、ITS-2基因以及部分28S rRNA基因，经测序得到的序列全长为1 360 bp～1 380 bp。根据谭磊等[8]参考NCBI中其同科的阔节裂头绦虫(Diphyllobothriumlatum序列号：KF218251.1)的基因组成对本试验所得裂头蚴基因序列进行具体分区，得到全部ITS-1基因序列、5.8S基因序列和ITS-2基因序列及部分18S rRNA基因和28S rRNA基因(表3)。本试验仅保留其ITS1和ITS2基因序列对得到的9条裂头蚴样品进行同源性分析，同NCBI的GenBank中欧猥迭宫绦虫裂头蚴FJ886747.1(Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE2)的ITS基因的生物同源性为95.70%～98.68%，证明本试验获得的裂头蚴为欧猥迭宫绦虫裂头蚴(Spirometraerinaceieuropaei)。

表3 本试验所得蛇类裂头蚴ITS基因序列分区情况

经GenBank检索有代表性的曼氏叠宫绦虫属绦虫6个(序列号：FJ886747.1、FJ886751.1、FJ886746.1、FJ886752.1、HQ228993.1、KC561781.1)，阔节裂头绦虫(序列号：KF218251.1)、扩展莫尼茨绦虫(序列号：AB367793.1)、脑多头蚴(序列号：LC271468.1)、犬复孔绦虫(序列号：AM491338.1)、细粒棘球绦虫(序列号：ITS-1：KJ363922.1；ITS-2： KR872308.1)以及作为外群的捻转血矛线虫(序列号：ITS-1：KC998766.1；ITS-2：LC360163.1)各1个，将其ITS1和ITS2基因序列与本试验所得裂头蚴ITS1与ITS2序列应用DNA Star7.1软件的Megalign程序进行同源性分析，可以看出各个序列之间的同源性与差异性的百分比(图5)。本试验所得裂头蚴ITS序列与GenBank中欧猥迭宫绦虫裂头蚴之间序列同源性为95.9%～99.8%；与其他绦虫同源性低于77.9%，同时本试验所得各虫体的ITS基因之间同源性为98.9%～100%，同源性较高。

图5 ITS基因序列同源性性对比

从碱基组成角度来看，本试验得到的裂头蚴ITS1基因的A、T、C、G碱基的平均含量为15.63%、30.83%、22.88%、30.62%。ITS2基因的A、T、C、G碱基的平均含量为13.62%、32.29%、22.93%、31.19%。经DNA Star7.1软件分析可知裂头蚴样本ITS基因序列同已知参考序列FJ886747.1(Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE2)对比，存在的碱基点突变数平均为6.11，碱基缺失数平均为21.44，碱基插入数平均为9.89。使用MEGA7对所得序列进行遗传距离的计算可知，本试验样本之间的遗传距离为0～0.004 1，平均遗传距离为0.001 6，与已知参考序列的遗传距离为0.003 0～0.004 3，与其他绦虫遗传距离大于0.016 3(表4)。

表4 本试验所得蛇类裂头蚴ITS基因序列突变情况

2.3.2 NAD4基因序列分析 经测序得到裂头蚴的NAD4序列全长在356 bp～650 bp，与NCBI GenBank中HM475076.1欧猥迭宫绦虫裂头蚴的同源性为96.73%～100%。由此可证明本试验获得的裂头蚴为欧猥迭宫绦虫裂头蚴(Spirometraerinaceieuropaei)。经GenBank检索有代表性的7个欧猥叠宫绦虫属绦虫(序列号：HM475076.1、KF745185.1、KF745179.1、HM475083.1、HM475094.1、KF656763.1、HM475079.1)、细粒棘球绦虫(序列号：41697831)和扩展莫尼茨绦虫(序列号：34926715)的NAD4基因序列，与本试验所得序列应用DNA Star7.1软件的Megalign程序进行同源性分析，可以看出各个序列之间的同源性与差异性的百分比(图6)。本试验所得裂头蚴NAD4序列与GenBank中欧猥迭宫绦虫裂头蚴之间序列同源性为89.1%～100%，与其他绦虫同源性小于70.2%；且本试验得到的各虫体的NAD4基因之间的同源性为93.0%～100%，有一定的差异性。

图6 NAD4基因序列同源性性对比

从碱基组成角度来看，本试验得到的裂头蚴NAD4基因的A、T、C、G碱基的平均含量为16.30%、47.93%、13.03%、22.71%。经DNA Star7.1软件分析可知裂头蚴样本NAD4基因序列同已知参考序列HM475076.1对比，存在的碱基点突变数平均在15.67，碱基缺失数平均为0，碱基插入数平均为0。使用MEGA7对所得序列进行遗传距离的计算可知，本试验样本之间的遗传距离为0～0.010 1，平均遗传距离为0.004 1，与已知参考序列的遗传距离为0～0.011 6，与其他绦虫遗传距离大于0.023 3(表5)。

表5 本试验所得蛇类裂头蚴NAD4基因序列突变情况

2.3.3 COX3基因序列分析 经测序得到裂头蚴的COX3序列全长为379 bp～408 bp，与NCBI GenBank中HM475033.1欧猥迭宫绦虫裂头蚴的同源性为98.94%～100%。由此可证明本试验获得的裂头蚴为欧猥迭宫绦虫裂头蚴(Spirometraerinaceieuropaei)。经GenBank检索有代表性的6个欧猥叠宫绦虫属绦虫(序列号：HM475033.1、HM475029.1、KF745159.1、KF745165.1、HM475037.1、HM475038.1)、细粒棘球绦虫(序列号：41697846)和扩展莫尼茨绦虫(序列号：34926731)的COX3基因序列，与本试验所得序列应用DNA Star7.1软件的Megalign程序进行同源性分析，可以看出各个序列之间的同源性与差异性的百分比(图7)。本试验所得裂头蚴COX3序列与GenBank中欧猥迭宫绦虫裂头蚴之间序列同源性为96.7%～100%，与其他绦虫同源性小于64.5%；且本试验得到的各虫体的COX3基因同源性为96.8%～100%，存在一定的差异性。

图7 COX3基因序列同源性性对比

从碱基组成角度来看，本试验得到的裂头蚴COX3基因的A、T、C、G碱基的平均含量为17.56%、47.96%、11.20%和23.28%。软件分析可知裂头蚴样本COX3基因序列同已知参考序列HM475033.1对比，存在的碱基点突变数平均为5.20，碱基缺失数平均为0，碱基插入数平均为0。使用MEGA7对所得序列进行遗传距离的计算可知，本试验样本之间的遗传距离为0～0.009 0，平均遗传距离为0.003 8，与已知参考序列的遗传距离为0.002 5～0.007 0，与其他绦虫遗传距离大于0.029 1(表6)。

表6 本试验所得蛇类裂头蚴COX3基因序列突变情况

2.3.4 系统发生树分析 选取本试验所得3种基因序列使用MEGA7.0软件的NJ法绘制序列系统发生树。通过种系发育分析显示，本试验所得欧猥迭宫绦虫裂头蚴ITS基因序列有较高的同源性，与NCBI数据库中的FJ886747.1(Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE2)、FJ886752.1 (Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE7)和HQ228993.1(Spirometrasp.JL-2010)同属于一个分支。舟山眼镜蛇4号裂头蚴样品与王锦蛇3号、4号裂头蚴样品与HQ228993.1和FJ886752.1亲缘关系较近，其余样品与FJ886747.1亲缘关系较近。本试验所得所有裂头蚴样品亲缘关系与同科的阔节裂头绦虫KF218251.1亲缘关系较近而与其他绦虫的亲缘关系较远(图8)。

图8 裂头蚴ITS基因序列系统发生树

本试验所得欧猥迭宫绦虫裂头蚴NAD4基因与NCBI数据库中的欧猥迭宫绦虫裂头蚴NAD4基因序列属于同一大分支，但三明株舟山眼镜蛇裂头蚴与HM475076.1、KF745185.1和KF745179.1亲缘关系更近；而漳州株王锦蛇裂头蚴与HM475083.1和HM475094.1亲缘关系更近；试验所得欧猥迭宫绦虫裂头蚴与其他绦虫亲缘关系较远(图9)。本试验所得欧猥迭宫绦虫裂头蚴COX3基因与NCBI数据库中的欧猥迭宫绦虫裂头蚴COX3基因序列属于同一大分支，三明株舟山眼镜蛇裂头蚴与 KF745165.1、HM475033.1、HM475029.1和KF745159.1亲缘关系更近；而漳州株王锦蛇裂头蚴与HM475037.1和HM475038.1亲缘关系更近；试验所得欧猥迭宫绦虫裂头蚴与其他绦虫亲缘关系较远(图10)。

图9 裂头蚴NAD4基因序列系统发生树

图10 裂头蚴COX3基因序列系统发生树

3 讨论

自1999年以来，我国是世界上发生裂头蚴病病例最多的国家，在34个省(自治区、直辖市)中，有27个省(自治区、直辖市)共报告了近1 000例人类裂头蚴病病例[15]。裂头蚴病对人类健康构成严重威胁，也会造成重大的经济损失。因此，研究野生动物体内的裂头蚴自然感染和系统发育，对于预防和控制裂头蚴病，了解寄生虫的序列变异和遗传结构具有重要意义[16]。福建省蛇类寄生虫的遗传分析研究数据基本属于空白，本试验通过在福建省三明市、漳州市和南平市某些蛇场进行采样，得到了一些寄生在蛇体内的裂头蚴样本并对其进行研究分析。

随着分子生物学的发展和PCR技术的成熟，这些技术为寄生虫的分子生物学鉴定和分类提供了基础。传统的以形态学为主要依据的鉴定方式具有一定的局限性，所以通过分子生物学手段进行物种鉴定则显得尤为重要。ITS基因是核糖体DNA (rDNA)中介于18S和28S之间的内转录间隔区，包括ITS-1和ITS-2两段序列，种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异[17]。本试验对裂头蚴样品的ITS基因序列进行PCR扩增，测序得到序列与NCBI Blast公布的序列比对，结果表明该样品为欧猥迭宫裂头蚴(Spirometraerinaceieuropaei)，且与NCBI中公布的欧猥迭宫裂头蚴ITS序列的同源性均高于95.90%,而与其他绦虫的同源性均低于77.9%。本试验裂头蚴样本之间的遗传距离为0～0.004 1，平均遗传距离为0.001 6，与已知参考序列的遗传距离为0.003 0～0.004 3，与其他绦虫遗传距离大于0.016 3。从而显示利用ITS基因可以使欧猥迭宫裂头蚴与其他得到很好的鉴别。谭磊等[8]曾对湖南省黑斑蛙裂头蚴进行ITS基因扩增，得到的ITS1和ITS2基因序列长度分别为611 bp～689 bp和490 bp～502 bp，样本之间同源率分别为95.4%和94.6%，与其研究相比，本试验ITS2基因序列略短一些，但ITS基因序列整体同源率更高，可见福建株蛇源裂头蚴ITS基因序列保守性较湖南株更高。本试验得到的ITS基因序列存在着少量的点突变，但却有较多碱基缺失和插入的情况，个体之间存在着一些差异，而18S、5.8S和28S则种内相对保守，所以ITS基因作为物种种内鉴定的分子标记相对具有优势。线粒体是真核细胞的一种细胞器，它有拥自己的基因组，具有结构简单、母系遗传、缺少重组、进化速率快等特点，是对物种进行遗传学鉴定的理想分子标记。所以本试验对裂头蚴线粒体NAD4基因和COX3基因进行PCR扩增，与NCBI GenBank公布的欧猥迭宫裂头蚴序列比对。试验样本NAD4基因与参考序列的同源性为89.1%～100%，与其他绦虫同源性小于70.2%。样本之间的遗传距离为0～0.010 1，平均遗传距离为0.004 1，与已知参考序列的遗传距离为0～0.011 6，与其他绦虫遗传距离大于0.023 3。试验样本COX3基因与参考序列的同源性为96.7%～100%，与其他绦虫同源性小于64.5%。样本之间的遗传距离为0～0.009 0，平均遗传距离为0.003 8，与已知参考序列的遗传距离为0.002 5～0.007 0，与其他绦虫遗传距离大于0.029 1。伍慧兰[11-12]曾对湖南省黑斑蛙裂头蚴进行NAD4和COX3基因扩增，得到NAD4基因序列长度为640 bp，变异率在2.3%～2.5%；COX3基因长度为264 bp，样本间同源率高于98%，与其研究相比，本试验的得到的COX3基因序列较长，且本试验得到的NAD4和COX3基因同源率略低，可见福建株蛇源裂头蚴NAD4和COX3基因序列保守性较湖南株略低。从总体来看本试验得到的裂头蚴NAD4和COX3基因虽然没有碱基缺失和插入的情况，但是个别个体碱基突变较多。从本试验结果可以看出，COX3基因比NAD4基因更加保守，虽然个别个体的基因序列存在较多的突变情况但是仍然可以将欧猥迭宫绦虫与其他绦虫进行区分，并且从进化树分析来看，本试验获得的三明株和漳州株的裂头蚴NAD4和COX3基因在进化树同一大分支上存在着不同的分化，由此可见NAD4和COX3基因在物种的地域性鉴别上有一定的优势。

通过对裂头蚴已有的生活史研究进行分析，本试验所采样的饲养场在蛇类幼年期都存在使用蛙类给蛇作为开口饲料的情况，而蛙类饲料有些是通过抓捕的野生蛙获得的。养殖蛇类有极大可能通过采食感染了裂头蚴的野生蛙继而感染裂头蚴。如果人类对寄生有裂头蚴的蛇肉处理不当并食用，便有极大的可能感染裂头蚴，从而对身体健康造成极大的危害。因此，防控养殖动物的裂头蚴感染刻不容缓，提醒养殖户对养殖蛇类的饲料进行把控，切断裂头蚴的传播途径，以保证蛇肉的食品安全。由于野生蛇类的裂头蚴感染可能会更加严重，所以同时提醒对蛇肉有偏好的消费者选择正规养殖场的健康蛇类并且食用时做好处理，拒绝食用野生蛇类。本试验所得结果为福建省舟山眼镜蛇裂头蚴的分子生物学研究提供了依据，为以后福建省蛇源裂头蚴的分子流行病学调查及种群遗传学等更深入的研究奠定了基础。