成都市猫诺如病毒的检测及VP1基因序列分析

黄思琦，黄 坚，杨晓农，郭 琪，李 妍

(西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041)

猫诺如病毒(Feline norovirus, FNoV)属于杯状病毒科(Caliciviridae)诺如病毒属(Norovirus)，为无囊膜的单股正链RNA病毒[1]。基因组全长约7.5 kb，含有编码非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP)的3个开放阅读框(open reading frames，ORFs)[2]。ORF1编码6个非结构蛋白，其中RNA聚合酶区域在杯状病毒科中高度保守，为检测常用的靶基因。ORF2编码分子质量约57 ku的病毒主要衣壳蛋白VP1，该蛋白能自动装配并形成病毒衣壳，根据其序列同源性差异可将诺如病毒分为7个基因群[3-4]。其中猫诺如病毒分为GⅣ基因群与GⅥ基因群，在美国和巴西已检测出GⅣ基因群[5-6]，在意大利则为GⅥ基因群[7]，日本报道同时存在GⅣ和GⅥ基因群[8-9]。诺如病毒可感染人、猫、犬、猪、牛、狮子等多种动物[10-12]，主要经消化道途径传播，以幼龄和老龄者最为易感。人类的非细菌性胃肠炎中，50%以上是由诺如病毒感染导致的[2]。

自2010年美国首次从猫腹泻样本中检测出FNoV[5]，随后在日本[8-9]、巴西[6]、意大利[7]的猫腹泻样本中也相继检出。目前文献报道用于检测FNoV的PCR引物有3对，均针对病毒保守的RNA聚合酶3'端区域。其中广泛性引物p289d-p290d为最早建立的检测杯状病毒科的引物[13]，用于不同物种的诺如病毒的检测[7-8,14]，该引物被多次用于不同国家猫腹泻样本中FNoV的检测[5-9]。引物JV12Y/13I为检测诺如病毒的特异性引物[15]，有研究将其与引物p289d-p290d联合用于FNoV检测[7]。引物FNoV-F9/R15是基于FNoV序列而设计的特异性引物[5]，有研究表明使用该引物的检出率(6/14)高于使用广泛性引物p289d-p290d的检出率(3/14)。可见，使用不同检测引物的检测灵敏度存在差异。目前国内尚未有FNoV流行情况的报道，而基于已有的FNoV分子检测方法的敏感性比较研究也并不完整，为此笔者选用文献报道的3对FNoV检测引物对成都市猫群的粪便样本进行检测和复核，拟筛选出最适合的FNoV检测引物，并初步掌握成都市FNoV的流行情况和流行毒株的分子特征，为FNoV的持续监测及进一步防控提供重要的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床病例 于2019年8月-12月自四川成都市区5家动物医院收集的127例猫粪便样本，其中腹泻样本71例(公猫占50.7%，母猫占49.3%；小于1岁龄占88.7%，不低于1岁龄占11.3%)，正常粪便样本56例(公猫占58.1%，母猫占41.9%；小于1岁龄占85.7%，不低于1岁龄占14.3%)。

1.1.2 主要试剂 Trizol、氯仿、异丙醇、冰乙醇、DEPC水、大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞、DNA标准Ⅱ、DNA标准Ⅲ、DNA标准DL 2 000，天根生化科技(北京)有限公司产品；RNAiso Plus(Total RNA 提取试剂)、pMD19-T载体、Prime ScriptTMRT、PrimixTaqTM试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；Gel Extraction Kit胶回收试剂盒，Omega公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 恒温培养箱及恒温振荡培养箱，Thermoforma公司产品；高压蒸汽灭菌锅(YZB)，诸城安泰机械有限公司产品；旋涡仪，上海青浦沪西仪器厂产品； VersaDoc2000凝胶成像系统、PCR仪(CFX96)、Powerpac universalTM核酸蛋白电泳仪，Bio-Rad(美国)公司产品；高速离心机(5804)，Eppendorf公司产品。

1.1.4 引物信息 本研究合成了文献报道的3对检测引物，p289d-p290d[13]为针对杯状病毒科的广泛反应性引物，JV12Y/13I[15]为检测诺如病毒的引物，FNoV-F9/R15[5]为针对猫诺如病毒的检测引物,引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

同时合成特异性引物用于检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫星状病毒(Feline astrovirus,FAstV)和猫肠道冠状病毒(Feline coronavirus,FECoV)。FPV VP2(F:GGATGGGTGGAAATCACAGC; R: ATAACCAACCTCAGCTGGTC; 退火温度46 ℃)[16]；FAstV ORF1b(F:CTGGAAGAGCTATGACACCATTG; R:CCATGAACGCAGAGAGCAAC;退火温度56 ℃)[17]；FECoV N(F:GACGCGTTGTCCCTGTGTGTG; R:TCAATCTAGAGGAAGACACC;退火温度52 ℃)[18]。

1.2 方法

1.2.1 样品处理及总RNA提取 将采集到的病料在24 h内运回实验室，用1 000 μg/mL～2 000 μg/mL双抗+PBS，分装EP管，于-80 ℃反复冻融3次，5 000 r/min，离心8 min后，取300 μL上清液，采用Trizol法提取RNA，加入Trizol裂解液700 μL，剧烈混匀，室温静置5 min。加入200 μL氯仿，涡旋后室温下静置10 min。12 000 r/min、4 ℃离心15 min；取上清，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置10 min，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，弃掉上清，加入1 mL 750 mL/L DEPC乙醇，洗涤RNA沉淀及管壁，弹起沉淀物，涡旋，12 000 r/min、4 ℃离心10 min。弃去EP管中液体，晾干后加入20 μL DEPC水溶解，置冰上。

1.2.2 cDNA合成 采用TaKaRa反转录试剂盒，将提取好的RNA样本按照Prime ScriptTMRT Reagent Kit说明书的方法配制反应体系，将1.2.1提取的RNA反转录成cDNA。反转录体系为20 μL，含5 ×Prime Script buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、Random 6 mers 2 μL、RNA 4 μL、RNAase Free dH2O 9 μL。反转录反应条件：37 ℃，15 min；85 ℃，15 s；16 ℃，10 min，取出cDNA置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.3 PCR扩增及电泳检测 利用合成的3对检测引物分别以cDNA为模板进行PCR扩增，不同引物退火温度设置不同。反应体系为20 μL(2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL)。反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；49 ℃/50 ℃/57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35个循环；72 ℃ 10 min。经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定是否出现特异大小的条带，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 PCR方法扩增VP1基因片段 设计3对引物扩增VP1基因片段，反应体系为20 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，退火温度见表2，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

表2 PCR扩增VP1所用引物序列信息

1.2.5 VP1序列比对及进化树构建 将1.2.4的PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆至pMD19-T载体，并转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果拼接成完整的VP1核酸序列，与GenBank上的诺如病毒代表毒株的VP1序列进行同源性比对，并用MEGA7.0软件构建系统进化树。

1.2.6 统计分析 使用SPSS22.0,采用卡方检验(2)分析样本间的差异显著性，并进行方差分析和多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 采用不同引物扩增的检出率对比及临床样本检测

受检猫群中FNoV的检出率为9.45%(12/127)，其中临床腹泻样本中的检出率为11.26%(8/71)，临床健康样本中的检出率为7.14%(4/56)。使用文献报道的3对引物同时对127例猫粪便样本(含临床腹泻样本71例，临床健康样本56例)进行检测，结果显示使用广泛性引物p289d-p290d检出3例阳性样品(SMU-SC-CHN1/2019、SMU-SC-CHN2/2019与SMU-SC-CHN3/2019，均来自临床腹泻样本)，采用诺如病毒的特异性引物JV12Y/13I检出1例阳性样品(SMU-SC-CHN5/2019，为临床腹泻样本)，使用猫诺如病毒的特异性引物FNoV-F9/R15检出12例阳性样品(8例来自临床腹泻样本，4例来自临床健康样本)，扩增产物电泳结果见图1。使用引物FNoV-F9/R15的检出率(9.45%，12/127)高于使用引物p289d-p290d(2.36%，3/127)与引物JV12Y/13I(0.79%，1/127)的检出率。表3的结果显示，12例阳性样品均来源于小于1岁龄的幼猫，无性别和临床症状差异。临床腹泻样本或临床健康样本中4例为FNoV/FPV混合感染，3例为FNoV/FECoV混合感染，2例为FNoV/FECoV/FAstV混合感染，1例为FNoV/FPV/FECoV混合感染，1例FNoV/FECoV/FAstV/FPV混合感染，1例为单一FNoV阳性。

表3 FNoV阳性样品的信息列表

A.p289d-p290d;B.JV12Y/13I;C.FNoV-F9/R15;M.DNA 标准DL 2 000;1～12.临床样品；13.阴性对照A.p289d-p290d;B.JV12Y/13I;C.FNoV-F9/R15;M.DNA Marker DL 2 000;1-12.Clinical samples;13.Negative control

使用3对引物对临床样品的检出率差异较大，将引物分别与GenBank上猫诺如病毒美国毒株(GⅣ.2，GenBank登录号：JF781268)、日本毒株(GⅣ.2，GenBank登录号：LC389583；GⅥ.1，GenBank登录号：LC011951)、意大利毒株(GVI.2，GenBank登录号：KT245136)、巴西毒株(GenBank登录号：KM505133)的基因序列进行比对，发现引物JV12Y/13I、引物p289d-p290d均存在较多碱基无法与病毒序列匹配；而引物FNoV-F9/R15为3对引物中与病毒序列匹配度最高的引物，比对结果见图2。引物与病毒序列不匹配出现在3'末端会影响引物的扩增效率。使用Oligo 7.0分析显示引物JV12Y/13I的G/C含量偏低，且Tm值较低；引物p289d-p290d的3'端存在发夹结构且G/C含量偏低。从127例临床粪便样的检测对比结果显示，FNoV-F9/R15为3对引物中最适于临床检测扩增猫诺如病毒。

图2 3对引物与猫诺如病毒序列比对

将使用引物FNoV-F9/R15检出的12例阳性样品扩增产物测序结果与GenBank上的诺如病毒代表毒株的RNA聚合酶编码区基因进行比对分析，结果显示这12株临床样本间的核苷酸同源性为90.0%～100%。经MEGA7.0软件构建的系统进化树显示(图3)，12株临床样本均位于遗传进化树上猫科动物诺如病毒大分支中，与日本、美国、意大利、巴西的猫诺如病毒和意大利狮子诺如病毒汇聚在一起，从而确证这些临床样本中均存在FNoV。其中11个临床毒株与日本FNoV毒株M81(GIV.2，GenBank登录号：LC389583)亲缘关系最近，核苷酸同源性为90.0%～95.7%；而临床腹泻样本毒株CHN9与意大利毒株77-13(GVI.2，GenBank登录号：KT245136)同源性较高，为92.6%。12株临床毒株与犬诺如病毒(GIV.2)核苷酸同源性为80.9%～81.7%，而与人诺如病毒(GIV.1)核苷酸同源性为71.7%～74.8%。

2.2 VP1的扩增及序列分析

使用扩增VP1全基因序列的3对引物对12份阳性样本进行扩增，成功拼接获得了7株毒株的VP1全长基因序列(GenBank登录号：MT256404-256410)，序列长度为1 737 bp。测序结果分析表明，这7株FNoV的VP1核苷酸序列间同源性为89.0%～100%，氨基酸序列同源性为96.5%～100%。经MEGA7.0软件构建的系统进化树结果显示(图4)，FNoV分为GⅣ基因群和GⅥ基因群，7株临床毒株均分布于GⅣ基因群中的基因2型(GⅣ.2)的分支上，与美国毒株(GenBank登录号：JF781268)和日本毒株M81(GenBank登录号：LC389583)亲缘关系近。其中CHN1、CHN5、CHN6临床毒株与美国毒株亲缘关系最近，核苷酸同源性为95.2%～95.6%，氨基酸同源性为98.2%～98.4%。CHN10临床毒株(临床健康样品)则与日本毒株M81位于同一小分支，核苷酸同源性为96.7%，氨基酸同源性为98.9%。而CHN2、CHN3、CHN4临床毒株则聚为独立的一小分支。在诺如病毒GIV基因群中还包括犬诺如病毒及人诺如病毒，分析显示这7株临床毒株与犬诺如病毒(GⅣ.2)核苷酸同源性为82.1%～82.7%，氨基酸同源性为90.5%～91.2%；与人诺如病毒(GⅣ.1)核苷酸同源性为66.7%～67.5%，氨基酸同源性为69.1%～70.6%。对推导的VP1蛋白序列分析发现，CHN2、CHN3、CHN4临床毒株上存在不同于GⅣ.2基因型其他FNoV毒株(日本、美国毒株及CHN1、CHN5、CHN6、CHN10临床毒株)的11个共有氨基酸变异位点，分别位于VP1蛋白的S区(3个)、P1区(4个)及P2区(4个)。其中P1区271位氨基酸，P2区385位、427位、428位氨基酸存在极性或酸碱性变异。基于VP1基因序列的遗传进化树结果表明，成都地区流行的FNoV毒株均为GⅣ基因群中的基因2型(GⅣ.2)，且病毒在不断变异，已呈现共有的氨基酸变异位点。

●临床腹泻样本；○临床健康样本●Clinical diarrhea samples;○Clinical healthy samples

3 讨论

对成都市127例猫粪便样本的检测结果提示，引物FNoV-F9/R15为目前最适于临床检测FNoV核酸的RT-PCR引物。虽然3对引物均是对病毒RNA聚合酶保守区域进行扩增，但引物FNoV-F9/R15是根据猫诺如病毒基因序列设计的特异性引物[5]，序列比对结果也显示其与不同基因型的FNoV序列具有较高的匹配度，这十分有利于引物退火后顺利进行延伸和扩增。而另外2对引物可用于检测多个物种的诺如病毒，因此与FNoV序列的匹配差异也体现出毒株的种属差别，此外引物分析结果也证实了这2对引物存在GC含量低、Tm值偏低、3'端发夹结构以及3'端自由能偏低等问题，可能也是导致二者检出率低的原因。在一项关于犬诺如病毒(CNoV)的检测报道中，研究人员也证实了使用针对CNoV的特异性引物的检出率(27.6%，29/105)远高于使用引物JV12Y/13I(1.9%，2/105)及引物p289d-p290d(0%，0/105)[14]的检出率。因此，在选择或设计检测引物时应充分考虑病原的种属特异性，从而提高真实检出率，避免漏检。

在过往的若干报道中，研究人员仅从临床腹泻样品中检出了FNoV[5-9]，而作者从腹泻和临床健康样本中均检出了FNoV，提示临床健康猫可携带FNoV。已有的报道证实FNoV具有致病性，将FNoV(M49-1，GⅥ.1)毒株接种2月龄～3月龄SPF猫，能引起猫腹泻，并且能从血清及腹泻样本中检出病毒核酸[9]。但不同基因型的病毒其致病力存在差异[10]，本研究获得的FNoV流行株均为GⅣ.2基因型，并且存在于其他猫肠道病毒混合感染的情况。我们前期的相关研究结果提示[17]，猫携带多种病毒性肠道病原可能是普遍现象，当环境改变、机体免疫力下降及其他病原感染并存时，病毒可加快复制从而导致相关消化道症状，因此该基因型毒株是否具有单独致病性仍需进一步研究。

VP1序列分析结果显示，成都市的FNoV与美国和日本的GⅣ.2毒株亲缘关系较近，推测可能是通过品种猫的引种繁殖使FNoV在国内传播。有趣的是，临床毒株CHN2、CHN3、CHN4的VP1蛋白序列出现了11个不同于FNoV其他GⅣ.2毒株的共有氨基酸变异位点，这些位点所在的P1-P2区为诺如病毒的免疫识别和细胞黏附的关键区域[19]。已有的研究表明，人诺如病毒GⅡ.4的P2区域变异易产生抗原漂移导致免疫逃避，从而产生新的流行毒株[20]，而临床FNoV毒株出现的VP1蛋白的变异，特别是在P1区(4个)及P2区(4个)的共有氨基酸变异是否具有相似作用仍需要进行深入研究。

目前尚无直接证据表明猫诺如病毒可以跨种间传播，但从英国、巴西、西班牙和葡萄牙采集的临床宠物医生的血清样本检测出犬诺如病毒GⅥ抗体(22.3%，83/373)，而非临床宠物医生的血清样本抗体检出率仅为5.8%(7/120)[21]。另外一项研究也表明，92份主人表现胃肠道症状的犬粪便样本中检测了出4份人诺如病毒GⅡ[22]。虽然我们没有进行FNoV的抗体血清学调查，但可以推测的是，在猫与人类密切接触的共居环境中，猫与人的诺如病毒可能会发生交叉感染以及引发相关疾病，需要引起持续关注。