miR-100-5p用于肝癌患者预后判断的临床意义分析

何兴桢 潘翔 郑培奋

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤之一，其预后较差，严重威胁我国人口的健康[1-2]。HCC早期症状不典型，起病隐匿，且具有高恶性程度、高复发、高转移率等特点，因此尽管目前对于HCC的治疗方法逐渐增多，包括手术治疗、介入治疗、放化疗及靶向治疗等[3]，但HCC患者预后仍不理想。因此，如果能够发现HCC早期诊断、治疗以及预后相关的生物标志物，将对临床诊疗有重要的意义。

随着大数据时代的到来，目前生物信息学在肿瘤中的应用越来越广，通过生物信息学分析寻找HCC中异常表达的基因，可为寻找HCC的生物标志物提供依据。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，由于miRNA在组织、血浆中可稳定存在，并在肿瘤组织中存在异常表达，且可调控肿瘤细胞增殖、转移、凋亡等细胞学进程，是可选的生物标志物之一[4-5]。miR-100-5p作为miRNA家族的一员，在膀胱癌、神经胶质母细胞瘤等肿瘤中均存在异常表达，并和疾病分期及预后相关[6-7]。而在HCC中，有学者发现miR-100-5p表达水平低于正常肝脏组织，与患者预后相关，且过表达miR-100-5p可抑制HCC进展[8-9]。为进一步明确miR-100-5p在HCC患者预后中的临床意义，本研究通过生物信息学分析及组织标本表达检测，评估miR-100-5p用于不同临床特征HCC患者预后监测的临床意义。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2004年1月至2013年12月于浙江医院就诊的HCC患者118例，其中男77例，女41例，年龄 21～79（50.29±14.00）岁。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）患者需经病理确诊为HCC（诊断依据为2010版AJCC癌症分期手册），有完整的临床数据及随访信息；（3）患者不存在其他原发肿瘤相关疾病。末次随访时间为2018年12月，所有患者均知情同意，本研究经浙江医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 Trizol、逆转录试剂盒以及SYBRGreen PCR kit试剂盒均购自中国赛默飞世尔科技有限公司；miR-100-5p前引物购自中国上海吉马生物技术有限公司。

1.3 实验方法 获取HCC石蜡组织块，按说明书方法使用Trizol提取标本中总RNA，并测定提取得到的总RNA浓度，以1 μg总RNA为底物，在普通PCR仪上进行逆转录。采用逆转录试剂盒进行反转录，获取cDNA。反应条件：37℃，60 min；95℃，5 min。以cDNA为模板，使用miScript SYBR-Green PCR kit试剂盒进行RT-qPCR检测。RT-qPCR所用引物如下：miR-100-5p前引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAACCCGTAGATCCGA-3′，后引物：通用引物。内参U6前引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；后引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应体系：模板cDNA1μl，miR-100-5p上游引物1 μl，10*miScript通用引物 2 μl，2*Quanti TectS YBR Green PCR Master Mix 10 μl，加无酶水至总反应体积20 μl。反应条件：95 ℃，15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70℃，30 s；共计40个循环。

1.4 TCGA数据库验证 TCGA数据库（www.cancergenome.nih.gov）中可获取HCC患者预后数据，通过数据库中患者预后信息和miR-100-5p表达水平绘制生存曲线，以miR-100-5p表达水平中位数为界，将患者分为miR-100-5p低表达组和高表达组。采用log-rank检验进一步验证miR-100-5p和HCC患者预后的相关性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；采用Kaplan-Meier分析和log-Rank检验绘制生存曲线；采用单变量和多变量Cox回归分析miR-100-5p和患者预后的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织miR-100-5p低表达、高表达与临床特征的关系 miR-100-5p低表达、高表达与临床分期有关，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤长径无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

2.2 HCC组织miR-100-5p表达和患者预后的关系对影响HCC预后的相关临床因素进行单因素和多因素分析，结果显示肿瘤高分期和miR-100-5p低表达是HCC预后的独立危险因素（均P＜0.05），其HR值及95%CI分别为 0.269（0.138～0.523）、2.569（1.277～5.169），见表 2。

miR-100-5p低表达组预后生存率明显低于高表达组患者（P＜0.01，图1a），这和TCGA数据库中的预测的结果相同（P＜0.01，图1c）。且高分期（Ⅲ+Ⅳ期）HCC患者预后生存率低于低分期（Ⅰ+Ⅱ期）组（P＜0.01，图1b）。并且在不同亚组中miR-100-5p表达水平与HCC预后关系各不相同，其中在高分期（图2b）、低龄（≤60岁）（图 2c）、男性（图 2e）、小组织（肿瘤长径≤5 cm）组（图2g）中，低表达miR-100-5p患者的生存时间更短差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而在低分期（图2a）、高龄（＞60岁）（图2d）、女性（图 2f）、大组织（肿瘤长径＞5 cm）组（图2h）中均未发现相关性（均P＞0.05）。另外，在大组织、女性亚组中miR-100-5p高表达和低表达组可观察到不同预后趋势，虽然差异均无统计学意义（均P＞0.05），但不能排除样本量过少所致偏倚，需扩大样本量后进一步验证。

表1 HCC组织miR-100-5p低表达、高表达与临床特征的关系（例）

表2 HCC组织miR-100-5p表达与患者预后关系分析

图1 miR-100-5p表达及肿瘤分期与患者预后生存的关系（a：石蜡标本miR-100-5p低、高表达患者预后分析；b：石蜡标本不同分期肝细胞癌患者预后分析；c：TCGA数据库中miR-100-5p低、高表达患者预后分析）

3 讨论

HCC作为常见的恶性肿瘤，其恶性程度高、预后差，对国民的生命健康产生了巨大的威胁。因此，提高HCC的诊断与治疗水平有着重要的临床意义。近年来HCC相关研究发现了越来越多新的生物标志物，但并无哪个标志物是完全理想的。目前，miRNA分子在HCC中的作用机制和临床意义被许多学者所关注，多种miRNA（如miR-217、miR-148a、miR-17等[10-12]）被发现在HCC组织中异常表达，并和HCC发生、发展相关。另外，miRNA分子在体外相对稳定，且易于检测，有作为生物标志物应用于HCC诊断、预后判断的可能。研究发现，miR-215、miR-150、miR-99a 等[13-15]miRNA 在 HCC组织中表达降低，miR-96、miR-155、miR-106b-5p等[14，16]在HCC组织中表达升高，这些在患者血浆或组织中异常表达的miRNA和患者临床分期相关，这将可能用于HCC的早期诊断或靶向治疗，并对判断肿瘤的恶性程度和预后有着一定的临床意义。

近年来，多项研究发现miR-100-5p在肿瘤中存在异常表达，并具有一定临床意义。如在口腔鳞状细胞癌中，低表达miR-100-5p提示患者预后较差[17]。在非肌层浸润膀胱癌组织中，miR-100-5p低表达组的膀胱癌患者无疾病进展时间和肿瘤特异生存时间明显长于高表达组，具有临床意义[6]。在神经胶质母细胞瘤中，血清miR-100-5p低表达患者预后生存时间明显低于高表达患者，这表明miR-100-5p可用于判断患者的预后[7]。

图2 各个不同亚组miR-100-5p表达与患者总体预后生存的关系（a：低分期亚组；b:高分期亚组；c：低龄亚组；d：高龄亚组；e：男性亚组；f：女性亚组；g：小组织亚组；h：大组织亚组）

在HCC中，已有关于miR-100功能或临床意义的相关报道。Ge等[8]研究发现，过表达miR-100可通过抑制HCC细胞自噬诱导细胞凋亡以及抑制HCC细胞的增殖。另一项研究发现，miR-100和miR-125b可通过抑制血管生存从而抑制HCC的转移[18]。以上研究均表明，miR-100可能作为HCC靶向治疗的靶点之一。

前期已有Chen等[9]研究发现，miR-100在HCC组织中表达降低，且是HCC预后的独立危险因素。本研究通过石蜡标本检测miR-100-5p在HCC组织中的表达，并分析其表达水平和患者临床特征间的相关性。结果发现低表达miR-100-5p和HCC较高的临床分期具有相关性，且低表达miR-100-5p患者预后较差，该结果与TCGA数据库分析结果一致。进一步的亚组分析结果显示，该结论在高分期、低龄、男性、肿瘤组织≤5 cm患者中依然适用。在低分期、高龄、女性、大组织亚组中，miR-100-5p表达和患者预后并无相关性。

综上所述，本研究通过样本检测及TCGA数据库分析发现，HCC组织miR-100-5p表达水平可用于预测HCC患者预后。miR-100-5p低表达是HCC患者预后较差的独立危险因素。在高分期、低龄、男性、肿瘤组织≤5 cm HCC患者，miR-100-5p低表达提示着较差的预后，在女性、肿瘤组织＞5 cm HCC患者中miR-100-5p的临床意义有待进一步验证。