miRNA-155对慢性心力衰竭的诊断效能及其与 β-catenin mRNA通路的相关性研究

蒋健刚 季宁宁 杜晓马 兰景良 葛晓平

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多数心血管疾病患者死亡的主要原因，随着我国人口结构的变化，其发生率、致残率和致死率不断增长，严重影响患者健康[1]。CHF临床症状缺乏特异度，合并其他疾病时其临床表现更为复杂，确诊和预后评估难度也更大[2]。因此，如何实现CHF的早期诊断、危险分层并及时干预已成为当前研究热点[3]。microRNAs（miRNAs）是一类内源性单链非编码RNA，其长度为18～25核苷酸，能降解靶信使RNA（mRNA）或抑制转录后翻译，从而调控基因表达[4]。miRNA-155是非编码RNA的一种，在CHF患者中呈高表达，且其表达水平与患者疾病严重程度存在相关性。β-catenin是Wnt信号通路中重要的调节蛋白，在静止细胞中可与E-Cadherin细胞内部结合，稳定细胞黏附，在Wnt信号激活中发挥重要作用[5-6]。本研究探讨miRNA-155在CHF患者中的诊断效能及与β-catenin通路的相关性，报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2018年4月至2020年4月金华市中医医院收治的CHF患者67例为观察组，其中男40例，女 27 例，年龄 42～76（59.85±5.61）岁；冠心病 41例，高血压病11例，扩张型心肌病10例，风湿性心脏病5例；心功能分级 Ⅱ级26例，Ⅲ级30例，Ⅳ级11例，均经心脏超声、实验室等检查确诊[7]。并选择同期治疗的非CHF心血管疾病患者45例作为对照1组，男26 例，女 19 例，年龄 41～78（60.12±5.67）岁；冠心病 29例，高血压7例，扩张型心肌病6例，风湿性心脏病3例。另选择同期健康体检者39例作为对照2组，其中男 21 例，女 18例，年龄 41～78（59.73±5.65）岁。排除标准：（1）合并结缔组织疾病及急慢性感染者；（2）合并认知功能异常、急慢性脑血管疾病者；（3）肝肾功能异常或合并自身免疫系统疾病、血液系统疾病；（4）各种类型的肿瘤患者。3组对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究通过金华市中医医院伦理委员会审核批准（批号：20180126016）。所有对象均签署知情同意书。

1.2 方法 3组研究对象均空腹抽取外周静脉血5 ml，分离血清后放置在-80℃冰箱中备用。检测方法：取300 μl血清，采用Trizol法（试剂盒购自北京天根生化有限公司）提取总的RNA，将其溶于DRPC溶液中，用Narodrop法检测浓度和纯度。取1 μg的总RNA为模板，进行反转录cDNA的合成，得到目标cDNA后进行qRT-PCR反应（试剂盒购自大连宝生物工程有限公司）。整个反应体系总容量为20 μl，包括模板cDNA 1 μl、上下游引物各 1 μl、Taq 聚合酶 0.15 μl、dNTPs 1 μl、2×SYBR Green mix 10 μl加 DEPC H2O 7 μl。反应条件为30℃下10 min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，连续进行35个循环，72℃温控下延长10 min。引物由上海生工生物有限公司合成，见表1。miRNA-155和β-catenin均选用β-actin为内参基因，反应结果用相对对量法（2-ΔΔCt法）计算 miRNA-155 和 β-catenin的相对扩增倍数。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用方差分析，组间比较采用LSD-t检验。绘制ROC曲线，分析miRNA-155、βcatenin mRNA通路在CHF患者中的诊断效能（灵敏度、特异度）；采用Pearson相关对CHF患者miRNA-155与β-catenin mRNA通路表达水平的相关性进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组研究对象miRNA-155、β-catenin mRNA表达水平比较 见表2。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 3组研究对象miRNA-155、β-catenin mRNA表达水平比较

由表2可见，3组间miRNA-155和β-catenin mRNA表达水平不同，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。各组间比较发现，观察组miRNA-155表达水平高于对照1组和对照2组，β-catenin mRNA表达水平低于对照1组和对照2组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；对照1组miRNA-155表达水平高于对照 2组，βcatenin mRNA表达水平低于对照2组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。

2.2 miRNA-155、β-catenin mRNA通路表达水平对CHF的诊断效能 见表3。

表3 miRNA-155、β-catenin mRNA通路表达水平对CHF的诊断效能

由表3可见，miRNA-155、β-catenin mRNA 通路联合测定对CHF患者的诊断灵敏度、特异度均高于单一miRNA-155、β-catenin mRNA通路测定，差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。

2.3 CHF患者miRNA-155与β-catenin mRNA通路表达水平的相关性 见图1。

图1 CHF患者miRNA-155与β-catenin mRNA通路表达水平相关性

由图1可见，Pearson相关分析结果表明：CHF患者miRNA-155表达水平与β-catenin mRNA通路的表达水平呈负相关（r=-0.783，P＜0.05）。

3 讨论

CHF是多种心脏疾病发展到后期的一种临床综合征，主要表现为运动耐量的显著下降、明显的体液潴留及乏力、纳差等，其发病率随年龄增长而显著增加，严重影响患者的生活质量。因此早期准确诊断和评估病情，或将给CHF患者带来巨大获益[8]。miRNAs是由18～25个核苷酸构成的内源非编码单链小分子RNA、不仅具有结构、序列的高度保守性，而且可以直接参与机体的发育、分化[9]。既往研究表明：miRNAs能与靶mRNA尾随序列不完全/完全杂交方式结合，抑制mRNA的翻译，从而发挥作用[10]。每一个miRNA能调节多个不同的mRNA表达，并且同一个mRNA亦可由多个miRNAs调节。新近研究表明[11]：miRNAs能直接参与细胞的增殖、分化及凋亡，且多种疾病的病理过程均伴有miRNAs表达水平异常。由此可见：miRNAs能抑制下游基因表达直接参与疾病的发生、发展。miRNA-155属于miRNAs家族一员，不仅能促进动脉粥样硬化的形成，亦可通过Rheb/mTOR调节SK6基因的表达，加剧心力衰竭的发生、发展[12]。在本研究中，观察组miRNA-155表达水平均高于对照1组和对照2组，βcatenin mRNA表达水平均低于对照1组和对照2组；对照1组miRNA-155表达水平高于对照2组，βcatenin mRNA表达水平低于对照2组；这些均提示miRNA-155在CHF患者中呈高表达，可能可以直接参与疾病的发生、发展。miRNA-155在CHF患者中呈高表达，有望成为一种全新的预测CHF病情的生物标志物。在本研究中，ROC曲线结果表明：miRNA-155、βcatenin mRNA通路联合测定在CHF患者中的诊断灵敏度、特异度均高于单一miRNA-155、β-catenin mRNA通路的检测，提示miRNA-155和β-catenin mRNA通路联合测定在CHF患者中可能获得较高的诊断效能，或可用于指导临床诊疗[4]。Wnt信号传导途径由配体蛋白Wnt和膜蛋白受体构成，能激发下游通道的信号转导途径，借助细胞表面受体胞内活化，将细胞外的信号传递到细胞内[13]。目前，临床上Wnt信号途径具有细胞间交流和自体细胞交流两种形式，其在遗传学上高度保守，且不同的动物之间也较为相似[6]。而β-catenin是Wnt信号的重要组成部分，能在静止细胞中与E-Cadherin胞内部分相互结合，从而稳定细胞间黏附[14]。同时，在Wnt信号激活的细胞中从胞浆进入细胞核成为转录激活因子[5]。本研究结果发现，βcatenin mRNA通路在正常人体中处于一种动态平衡状态；但是对于CHF患者，持续的应激反应将会下调βcatenin mRNA通路，直接参与疾病的进展。进一步分析CHF患者miRNA-155与β-catenin mRNA通路的关系发现，CHF患者miRNA-155与β-catenin mRNA通路表达水平呈负相关，说明CHF患者miRNA-155与β-catenin mRNA通路存在紧密联系。因此，我们可以推断临床上对疑似CHF患者可进行miRNA-155表达水平测定，从而提高CHF的早期诊断率；对于确诊的心力衰竭患者应及时采取有效的治疗措施，且在治疗过程中也可对患者进行miRNA-155表达水平的测定，从而更科学地对患者预后进行评估，使得对患者的治疗更具科学性。

综上所述，miRNA-155在CHF患者中呈高表达，且与β-catenin mRNA通路存在显著的相关性，两者联合测定能获得较高的诊断效能，值得临床推广应用。