外周血ctDNA基因突变对早中期非小细胞肺癌患者的诊断效能分析

李鹤飞，王海波，李伟，史鸿云，贾友超

(1.河北大学附属医院胸外科，河北 保定 071000；2.河北大学附属医院放疗科，河北 保定 071000；3.河北大学附属医院肿瘤科，河北 保定 071000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要类型，也是目前临床上引起死亡的主要恶性肿瘤之一[1]。NSCLC患者临床确诊时通常处于中晚期，患者预后较差[2]。因此，加强对NSCLC患者的早期诊断并及时采取手术治疗对提高手术效果、改善患者预后具有重要价值。目前临床上通常采用胸部CT及外周血肿瘤标志物检测进行诊断，但存在CT假阳性、假阴性及肿瘤标志物非特异性的缺点[3]。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)来源于肿瘤组织，包含肿瘤组织全部遗传信息的生物大分子，具有与原发肿瘤相同的特征[4-5]。本研究分析外周血ctDNA基因突变对早中期NSCLC患者的诊断效能，为临床诊断及治疗提供参考。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

纳入2016年12月至2017年12月河北大学附属医院初诊初治且行单孔胸腔镜手术治疗的NSCLC患者50例为研究对象。其中男性34例，女性16例；年龄45～71(64.51±11.40)岁；有吸烟史30例，无吸烟史20例；腺癌40例，鳞癌10例；肿瘤直径≤3 cm 42例，>3 cm 8例；临床IA、IB、IIA及IIB患者分别为10例、22例、6例和12例。本研究已获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 纳入标准

胸部CT发现肺部小结节；病理学诊断为IA、IB、IIA、IIB期；临床资料完整且患者或家属签署知情同意书。

1.3 排除标准

并发其他恶性肿瘤患者；严重的代谢系统疾病患者；严重的认知功能障碍或神经系统疾病患者；临床资料不完整或不同意本研究患者；心脏、肾脏或肺功能明显异常患者。

1.4 实验方法

1.4.1 DNA 序列分析

抽取50例研究对象肘静脉血5 mL，1 500 r/min离心10 min。采用Qiagen DNA试剂盒提取总DNA。3 500 r/min离心15 min并收集沉淀；加入裂解液并静置60 min，加入蛋白酶K后50 ℃处理3 h；然后加入试剂3～5 mL，离心，弃上清后用70%的乙醇重悬，离心后弃上清。用TE液溶解沉淀，待用。采用96 rxn xGen Exome Research Panel v1.0试剂盒建立高通量测序文库，采用高通量测序平台(Illumina HiSeq 3000)对ctDNA进行测序。

1.4.2 肿瘤标志物检测方法

抽取所有研究对象空腹静脉血5 mL，离心(1 000 r/min，10 min)后分离血清，-80 ℃冰箱保存待用。血清中癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)水平检测采用放射免疫分析法进行，检测试剂购自罗氏公司，操作按照试剂盒说明书。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 NSCLC患者基本临床特征分析

本研究中50例非小细胞肺癌患者中男性为34例(68.00%)，女性为16例(32.00%)；>60岁患者26例(52.00%)，≤60岁患者24例(48.00%)；有吸烟史患者30例(60.00%)，无吸烟史患者20例(40.00%)；腺癌患者40例(80.00%)，鳞癌患者10例(20.00%)；肿瘤直径≤3 cm患者42例(84.00%)，>3 cm患者8例(16.00%)，临床IA、IB、IIA及IIB患者分别为10例(20.00%)、22例(44.00%)、6例(12.00%)和12例(22.00%)，见表1。

表1 NSCLC患者基本临床特征分析(n=50)

2.2 NSCLC患者外周血ctDNA检测敏感性分析

研究发现ctDNA检测NSCLC的敏感性为82.00%，明显高于CEA检测的敏感性(60.00%)，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 NSCLC患者外周血ctDNA检测敏感性分析(n=50)

2.3 ctDNA基因突变率与NSCLC患者年龄、性别、病理类型、临床分期、肿瘤大小及吸烟史的关系

研究发现ctDNA基因突变率在不同年龄、性别、病理类型、吸烟史等患者间差异无统计学意义(P>0.05)，而在不同肿瘤大小及临床分期患者中差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 ctDNA基因突变率与NSCLC参数的关系分析

3 讨论

肺癌已经成为发病率和病死率最高的恶性肿瘤，且发病率有逐年升高的趋势，而患者确诊时多处于中晚期，预后差、生存率低[6]。因此，加强NSCLC的早期诊断并采取措施进行积极治疗是改善患者预后的重要方面。NSCLC临床诊断目前多采用CT和肿瘤标志物进行初步筛查，但其在敏感性及特异性等方面存在一定的局限性。ctDNA与恶性肿瘤的遗传信息一致，且在外周血中的含量明显高于正常人群外周血中的含量。虽然手术为早期NSCLC患者的治愈提供了可能性，但晚期或有转移的患者失去最佳手术时机。对这群患者进行外周血ctDNA的检测能够提供他们疾病是否进展的重要信息。

ctDNA是循环血中游离于细胞外的肿瘤 DNA 片段，主要来源于肿瘤细胞的坏死、凋亡和分泌过程[7]。在肺癌治疗监测方面，晚期NSCLC患者在药物治疗过程中 ctDNA 水平和影像学负荷的关系，两者具有高度相关性，并且 ctDNA 监测比影像学更加敏感[8]。晚期肺癌基因突变更为复杂，ctDNA检测在晚期NSCLC治疗中具有重要的指导意义[9]。也有研究表示肿瘤标志物对评估疗效的敏感性强于ctDNA[10]，其可能与研究人员纳入的样本量相对较少有关。

本研究中，ctDNA检测早中期NSCLC的敏感性为82.00%，明显高于CEA检测的敏感性60.00%，差异有统计学意义(P<0.05)。提示与传统肿瘤标志物相比，外周血ctDNA基因突变对早中期NSCLC患者诊断有较高的敏感性。表明ctDNA基因突变率或可成为NSCLC早中期筛查的指标之一。目前有大量研究显示，ctDNA基因突变与早期肺癌存在相关性。但本文纳入的患者均为NSCLC患者，其特异性期待进一步研究。吕坤等[11]发现，ctDNA的高表达与早期肺癌发生关系密切，与本实验研究结果相似。这些研究提示，ctDNA的升高可能成为早中期肺癌的诊断依据，值得深入研究。此外，ctDNA基因突变率在不同年龄、性别、病理类型、吸烟史等患者间差异无统计学意义，但在不同肿瘤大小及临床分期患者中差异有统计学意义。提示本研究中ctDNA在早中期NSCLC可能为独立于年龄、性别、吸烟史等诊断因素；ctDNA基因突变率与NSCLC病理类型无关；ctDNA基因突变率与NSCLC肿瘤大小和临床分期有关。可能是由于外周血ctDNA来源于肿瘤细胞坏死释放，NSCLC肿瘤大小和临床分期与细胞凋亡数量有关。这也提示ctDNA基因突变可指导NSCLC的临床治疗。唐浩等[12]发现，早期肺癌的诊断和预测转移通过检测ctDNA可有指导意义。ctDNA浓度与肿瘤负荷相关，且其浓度变化趋势与放疗疗效有关[13]。ctDNA基因突变特征与NSCLC患者的放疗敏感性有关，结果可用于临床指导[14]。张萍等[15]也进行了脑脊液ctDNA检测结果指导肺癌脑转移病例的治疗。随着研究的不断深入和更多临床数据的获得，血浆中ctDNA检测技术必将为临床肿瘤早期诊断、预后判断、跟踪随访提供更多数据参考，且其可能成为一种比血清常见标志物更具敏感性和特异性的肿瘤标志物。期待以后的研究中增加研究纳入的病例，并采用多中心对比研究，同时分析患者术前术后外周血中ctDNA水平的变化，并对不同预后患者外周血ctDNA进行分析。

综上，外周血ctDNA基因突变可敏感诊断早中期NSCLC，且与肿瘤大小及临床分期有相关性。