基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用

李素一

摘要基因捕获是一种新的基因标签技术，被广泛应用于植物突变体库的构建及基因分离。近年来，基因捕获技术应用于水稻突变体库构建方面取得了显著进展；介绍了基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用。

关键词基因捕获；报告基因；水稻突变体库

中图分类号 Q343.1+3 文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）02-0125-02

水稻是世界上最重要的三大经济作物之一，同时也是生命科学研究的模式植物，水稻基因组的全序列得到破译之后，分离和研究水稻中的基因功能成为一项迫切而重要的任务。基因捕获是一种将带有报告基因的重组载体随机整合到基因组中，使插入基因被激活或失活，然后通过检测报告基因的表达和利用一些基于PCR的分子生物学技术来分离被插入基因的研究基因功能的新方法。目前，它已被广泛应用于植物突变体库的构建和基因分离。近年来，基因捕获技术应用于水稻突变体库构建方面取得了显著进展，本文介绍了基因捕获技术及其在水稻突变体库构建中的应用。

1基因捕获系统的类型

基因捕获包括3种系统类型：增强子捕获（enhancer trap）、启动子捕获（promoter trap）和基因捕获（gene trap），而基因捕获实际上是这3种类型的统称[1]。

1.1增强子捕获系统

增强子捕获系统是将报告基因与一个最小的启动子相连，组成一个增强子捕获重组体（见图1B）。典型的最小启动子含有TATA box及转录起始位点，它不能单独驱动报告基因的表达，只有当它被插入位点附近的增强子激活时，才可起始转录而使报告基因表达。由此可推知插入位点附近有增强子或基因，即实现了以该增强子捕获系统来发现增强子的目的。

1.2启动子捕获系统

启动子捕获系统中，利用一个无启动子的报告基因，随机插入在基因组中，当报告基因插入到内源基因的外显子中，且基因转录表达方向和该基因的阅读框一致时就会表达（见图1C）。通过检测报告基因是否表达则可知该报告基因附近是否有启动子，检测报告基因在生物体的什么部位表达即可知被插入基因的表达是否有特异性，从而起到了以之为诱饵，发现启动子的目的。

1.3基因捕获系统

狭义的基因捕获载体是指插入到结构基因内部从而捕获该基因的载体，带有一个不含启动子的报告基因，包括内含子捕获载体和外显子捕获载体（见图1D）。前者通常由报告基因和1个或者几个剪接受体位点（splice acceptor，SA）组成，剪接受体位点在报告基因上游。该重组体如果插入到基因组的内含子中，从染色体基因的剪接供体位点到报告基因的剪接受体位点的剪接就会使上游外显子与报告基因融合，从而使报告基因随着基因转录和表达。后者插入在基因的外显子，因此不需要添加SA位点就可以产生融合mRNA，所以如果能检测到融合转录物或融合蛋白，就可以证明插入位置附近有基因存在。

这3种捕获系统各有优缺点，增强子捕获不受插入位置的限制，且捕获频率往往较高，甚至可高达60%[2]。但由于增强子与基因的位置可近可远，故增强子捕获不易定位基因。启动子捕获系统捕获的频率比增强子捕获系统低，但它产生的突变频率较高。除转录融合外，启动子捕获和增强子捕获还能创造翻译融合，从而为蛋白质定位提供信息。

2基因捕获系统中插入元件的类型

基因捕获系统中，携带报告基因转入到植物基因组中去的插入元件主要有2种：T-DNA和转座子元件，二者各有优缺点。

2.1T-DNA

以T-DNA为介导的农杆菌转化已成为产生转基因植株的常用方法。T-DNA标签法是以人工构建好的T-DNA为标签，通过农杆菌转化，将其导入植物基因组中，使插入位点的基因被激活或失活，通过TAIL-PCR或Inverse PCR获得T-DNA的侧翼序列，进而捕获该基因。由于T-DNA的插入通常是比较稳定的，而且没有位点特异性，所以利用T-DNA标签的优点就可以创建饱和的T-DNA插入突变体库[3，4]。但它的一个不足之处在于T-DNA通常会在单一植株中造成多拷贝插入，可能是单个位点的多拷贝串联，也可能是多个位点的T-DNA插入。这会导致对基因捕获系统中报告基因表达模式的研究变得复杂。此外，插入事件中还往往有其他复杂的现象，比如T- DNA与临近染色体DNA的重排或者本身的同向或反向串联重复等[5]。这些情况都使被插入基因的分离和分析变得困难。

2.2转座子

转座子也常用来产生插入突变。常见的转座子有玉米的Ac/Ds 和En/Spm转座子，目前只有Ac/Ds系统可用于增强子捕获和基因捕获。Ac/Ds因为拷贝数低而得到广泛的应用，而En/Spm转座子因它的高拷贝数会导致报告基因表达的复杂化，所以较少被利用。

Ac/Ds系统由自主转座元件Ac和非自主转座元件Ds组成。Ac编码一个转座酶，与Ac和Ds的末端倒转重复序列相结合，催化其向基因组中的其他位置转座。Ds失去转座酶活性，不能编码转座酶，无法自主转座，但它尚保留末端倒位重复序列，能被Ac编码的转座酶识别，从而催化转座的发生。利用这种双元转座系统可以产生稳定的插入，还可通过有性杂交在转座植株中引入转座酶诱导再次转座，这时产生的转座可以引起回复突变，以验证所分离基因的功能。

3基因捕获系统中报告基因的类型

3.1β-葡萄糖苷酸酶基因

β-细菌的葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，gusA）是植物中常用的报告基因。用gus基因作为报告基因的主要优点是其产物GUS蛋白相当稳定，而且与其他蛋白融合后仍能保持生物活性。而GUS蛋白的活性很容易通过组织化学染色方法被检测到，这种检测非常灵敏，甚至能检测到gus在单细胞中的表达。但它的不足之处在于酶促反应底物相当昂贵，成本高。另外，组织化学染色会对活体组织造成破坏，因此GUS检测无法用于活体组织。

3.2绿色荧光蛋白基因

水母的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因也被广泛应用于植物的基因捕获中。因它的产物可发出荧光，因而只要有适当的光源即可被检测到，相对经济廉价。此外GFP的检测不具有破坏性，因而可进行活体检测。但GFP应用于植物中也有其限制性，例如GFP的表达量与植物本身的生理特征很有关系，GFP荧光素会随着叶片的成熟和叶绿素的增多而减少，另外，若是应用在禾本科植物中，厚厚的角质层会使荧光不容易透过[6]。

3.3其他可供选择的基因

除了常用的gus基因和GFP基因，来自玉米R基因家族的Lc基因极有希望成为一个新的报告基因。Lc调控花青素的生物合成，它在其他植物中的表达会导致花青素的积累[7]。用它作报告基因的优点在于不需要昂贵的底物，且不具有破坏性。

4基因捕获技术在水稻突变体库构建中的应用

随着农杆菌介导的水稻转化技术的成熟和不断完善，人们在水稻中已建立了具有一定规模的基因捕获突变体库[3]。Jeong等用激活标签法获得了50 000个突变系，分离到27 621个插入位点序列，经研究表明在预测的57 888个基因中共有15 166个发生插入突变[8]。Sallaud等利用3种T-DNA载体（p4978，p4984和 p4956ET15），在cv.Nipponbare中构建了一个含有40 000个T-DNA插入株系的水稻插入突变体库[9]。利用以gfp为报告基因的载体p4956ET15，法国的研究者们构建了一个增强子捕获突变体库，并已利用该突变体库进行种子繁殖和表型评价的研究[10]。

2002年，我国建立了第1个水稻T-DNA插入突变体库，该突变体库总共获得了12 000多个独立的T-DNA插入株系，表型分析和分子检测表明所获得的植株95%为转基因植株，单位点插入的株系约占2/3，并发现了一批与重要农艺性状相关的突变体，包括在株型、育性、生育期、分蘖、株高上有突变和抗病虫、抗逆、叶色等类型的突变体。由张启发院士主持的水稻重要农艺性状相关功能基因组研究课题组也创建了一个大型的T-DNA插入突变体库。至2005年时，该突变体库含有27 000个独立转化子，获得了功能基本明确且具有明显应用前景的新基因107个，其中有18个涉及到产量、品质、抗病、抗逆和营养高效等重要农艺性状的基因，如抗白叶枯病基因Xa26和Xa13、包台型恢复基因Rf1a和Rf1b、矿物质吸收相关的柠檬酸合成酶基因CS及抗逆基因OsNAC等[11]。2006年，他们将利用增强子捕获系统构建的一个含有129 000个水稻突变株系的群体整理成RMD（Rice Mutant Database，http：//rmd.ncpgr.cn）数据库，利用该数据库既能进行突变基因与调节元件的分离鉴定，也可以进行目标基因在特定组合或特定发育时期的异常表达模式[12]。张治国等在粳稻品种日本晴中获得了包括基因激活标签系和增强子标签系在内的近100 000份T-DNA独立插入标签系，其中有明显突变表型的捕获系共4 500余份，突变性状包括株高、株型、穗型、粒型和大小、生育期、育性、叶色、叶型、分蘖力等。Enokil等利用Ac转座子构建水稻插入突变体库，该突变群体有15%~50%的插入位点，在许多Ac的插入株系中，平均有4个Ac拷贝数[13]。Greco等利用增强子捕获载体建立了Ac/Ds插入突变体库，该群体的T0代植株62%表现出了转座活性，T1代植株92%有转座活性，而70%的T2、T3植株Ds失去了转座活性。对T1代植株插入位点侧翼序列进行分析，发现Ds的插入倾向于基因密度较高的区域[14]。

5结语

2005年在Nature上公布的水稻遗传图谱表明，水稻基因组12条染色体上共有37 554个基因。利用基因捕获所构建的这些水稻突变体库，无疑为分离和研究水稻中数目庞大的基因提供了一条有效的新途径。突变群体的构建为功能基因组学的深入研究搭建了一个极好的平台，相信不断发展和完善的基因捕获技术将会大大促进人们对于植物功能基因组学的研究。

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6参考文献

[1] SPRINGER P S.Gene Traps：Tools for Plant Development and Genomics[J].Plant Cell，2000（12）：1007-1020.

[2] CHANGYIN W，XINGJUN L，WENYA Y，et al.Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice gemome[J].J. Plant Journal，2003（35）：418-427.

[3] GUIDERDONI E，AN G，YU S-M，et al.T-DNA Insertion Mutants as a resource for rice functional genomics.In：Upadhyaya NM（ed）Rice Functional Genomics-Challenges，Progress and Prospects[M].New york：Springer，2007.

[4] 王凤华，李光远.T-DNA插入突变及其研究进展[J].河南农业科学，2007（6）：12-14.

[5] NAKANO S，UOTANI Y，UENISHI K，et al.DNA base flipping by a base pair-mimic nucleoside[J].Nucleic Acids Res，2005（33）：7111-7119.

[6] XIN ZHOU，RAUL CARRANCO，STANISLAV VITHA，et al.The dark side of green fluorescent protein[J].New phytologist，2005（5）：8-17.

[7] GOLDSBROUGH AP，TONG Y，YODER J. I.Lc as a nondestructive visual reporter and transposition excision marker gene for tomato[J]. Plant Journal，1996（9）：927-933.

[8] JEONG D H，AN S，PARK S，et al.Generation of a flanking sequence-tag database for activation- tagging lines in japonica rice[J].Plant Journal，2006（45）：123-132.

[9] SALLAUD C，GAY C，LARMANDE P，et al.High throughput T-DNA insertion mutagenesis in rice：a first step towards in silico reverse genetics[J].Plant Journal，2004（39）：450-464.

[10] JOHNSON AAT，HIBBERD JM，GAY C，et al.Spatial control of transgene expression in rice（Oryza sativa L.）using the GAL4 enhancer trapping system[J]. Plant Journal，2005（41）：779-789.

[11] LEI ZY，ZHAO，CAO MJ，et al.High-throughput binary vectors for plant gene function analysis[J]. J. Integr Plant Biol.，2007（49）：556-567.

[12] JIANWEI ZHANG，CAISHUN LI，CHANGYIN WU，et al.RMD：a rice mutant database for functional analysis of the rice genome[J].Nucleic Acids Research，2006（34）：745–748.

[13] ENOKIL，TAKESHI IZAWAL，MIHOKO KAWAHARAL，et al.Ac as a tool for the functional genomics of rice[J].Plant Journal，1999，19（5）：605-613.

[14] GRECO R，OUWERKERK PB，DE KAM RJ，et al.Transpositional behaviour of an Ac/Ds system for reverse genetics in rice[J].Theor Appl Genet，2003，108（1）：10-24.

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”