抑制肝癌细胞内质网应激可增强槐耳清膏的抗肿瘤作用

林 霄，孙国平，章 菊,2，刘加涛

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，晚期肝癌病死率位列第三，5年生存率仅为14%[1]。内科治疗是肝癌患者的主要选择，但治疗效果并不理想。近年来中药天然产物因其温和的副作用和优良的治疗效果受到许多关注[2]，研究[3-4]表明槐耳清膏在乳腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中均能起到有效的抗肿瘤作用。此外，无论是单独使用还是联合用药，槐耳清膏都表现出较低的细胞毒性[5]。许多药物在治疗肿瘤的同时能够引发肿瘤细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，而ERS是导致恶性肿瘤耐药的主要原因[6]，但槐耳清膏能否诱导肝癌细胞产生ERS尚不明确。该文首先探讨槐耳清膏在治疗肝癌的同时能否引发肝癌细胞ERS，再与ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)联合使用，探究抑制ERS能否增强槐耳清膏的抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源肝癌细胞株Hep3B和HepG2购自中国科学院细胞库。细胞系经STR鉴定，用qPCR分析细胞内无支原体。以高糖DMEM(美国Hyclone公司)加入10%胎牛血清(澳大利亚Clark公司)和青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/ml)配置成细胞培养液。细胞培养于37 ℃、5%CO2加湿的培养箱中。

1.2 主要试剂槐耳清膏(启东盖天利医药有限公司)用DMEM充分溶解，稀释成10 mg/ml，用0.22 μm滤膜过滤2次，保存在-80 ℃冰箱中。MTT检测试剂盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(上海贝博生物科技公司)，4-PBA(P21005，美国Sigma公司)，PMSF蛋白酶抑制剂、RIPA细胞裂解缓冲液(上海碧云天生物技术公司)，Bax(ab32503)、CHOP(ab11119)和GRP78(ab21685)一抗(英国Abcam公司)，PERK(BS2156)和Bcl-2(BS3171)一抗(美国Bioworld Technology Inc公司)，IRE1(#3294)一抗(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.3 MTT法测定细胞活力肝癌细胞(5 000个/孔)接种在96孔板中培养过夜，与不同浓度(0、2、4、6、8 mg/ml)的槐耳清膏共同孵育。培养24 h后，每孔中加入20 μl MTT，孵育4 h，然后加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶解甲醛晶体，水平摇床低速震荡10 min。用酶标仪在490 nm处测定吸光度(optical density,OD)值。根据公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%，槐耳清膏浓度为横坐标，肝癌细胞活性为纵坐标，绘制抑制曲线图，并计算槐耳清膏对2种肝癌细胞的IC50值。

1.4 Western blot将一组细胞单独使用槐耳清膏进行处理，另一组使用槐耳清膏与4-PBA联合用药，2组均处理24 h后消化收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，再用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA缓冲液在冰上裂解细胞30 min。将裂解液离心，收集上清液。加4×loading buffer，沸水煮10 min。用SDS-PAGE凝胶提取蛋白，转膜到PVDF膜上。再用5%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)在室温封闭1 h，4 ℃水平摇床与特异性一抗(1 ∶1 000)孵育过夜。隔日在室温下用二抗(1 ∶4 000)孵育1 h，用Image QuantTmlAS-4000Mini Imager检测实验结果，并用Scion图像软件(4.0.3.2版)进行量化。

1.5 流式细胞术分析将一组细胞单独使用槐耳清膏进行处理，另一组使用槐耳清膏与4-PBA联合用药。处理24 h后用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)对细胞进行消化。用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒按照说明检测细胞凋亡情况。用400 μl的Annexin V binding buffer重悬细胞，每管加入5 μl Annexin-V-FITC染色15 min，然后加入10 μl PI孵育5 min，上机检测。所有过程均避光操作。

2 结果

2.1 槐耳清膏浓度与肝癌细胞活力的关系为测定槐耳清膏对肝癌细胞活力的影响，采用不同剂量的槐耳清膏(0、2、4、6、8 mg/ml)与肝癌细胞株Hep3B和HepG2共培养24 h，采用MTT法检测细胞活力变化。与对照组相比，槐耳清膏能够抑制肝癌细胞活力(P<0.05)，Hep3B和HepG2细胞活力与槐耳清膏浓度呈剂量依赖性下降(图1)。

图1 MTT法测定肝癌细胞活力

2.2 槐耳清膏介导肝癌细胞凋亡的能力为了探讨槐耳清膏对肝癌细胞凋亡的影响，用AnnexinV-FITC/PI试剂盒进行了流式分析。结果显示槐耳清膏浓度为0、4、8 mg/ml时Hep3B细胞及HepG2细胞凋亡率明显升高，表明肝癌细胞凋亡率与槐耳清膏浓度呈正相关(图2A、B、C)。为了探究槐耳清膏诱导肝癌细胞凋亡的机制，使用Western blot检测细胞中Bax和Bcl-2的表达变化。如图2D、E、F所示，槐耳清膏可以下调肝癌细胞中Bcl-2的表达而上调Bax的表达，与对照组相比，Bcl-2/Bax下降(P<0.05)，促进肝癌细胞凋亡。

2.3 槐耳清膏诱导肝癌细胞发生ERS的能力槐耳清膏处理后的肝癌细胞内ERS相关蛋白GRP78、PERK和IRE1的表达与对照组相比明显上调(P<0.05)(图3)。结果表明槐耳清膏可以诱导肝癌细胞株Hep3B和HepG2产生ERS。

2.4 4-PBA抑制槐耳清膏诱导的肝癌细胞ERS用4-PBA(500 μmol/L)处理细胞12 h，将细胞与槐耳清膏(8 mg/ml)共培养24 h，通过Western blot检测细胞内ERS相关蛋白的表达。结果表明槐耳清膏联合4-PBA与单独使用槐耳清膏相比，肝癌细胞中IRE1和PERK的表达减少(P<0.05)(图4)，4-PBA可抑制槐耳清膏诱导的肝癌细胞ERS。

2.5 抑制肝癌细胞ERS对槐耳清膏的抗肿瘤作用的影响为了验证槐耳清膏诱导的肝癌细胞ERS是否会影响肝癌细胞凋亡，用4-PBA(500 μmol/L)处理肝癌细胞12 h，再将细胞与槐耳清膏(8 mg/ml)共培养24 h，用AnnexinV-FITC/PI试剂盒和Western blot进行检测。4-PBA联合槐耳清膏组与单独使用槐耳清膏相比肝癌细胞凋亡率明显上升(P<0.05)(图5A、B、C)。再用MTT法检测肝癌细胞活力，结果为4-PBA联合槐耳清膏与单独使用槐耳清膏相比肝癌细胞的活力明显下降(P<0.05)(图5D)。说明槐耳清膏诱导的肝癌细胞ERS能够抑制细胞凋亡，而联合4-PBA能抑制细胞ERS的发生，使肝癌细胞活力下降、凋亡率上升。

用Western blot检测了肝癌细胞内Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果表明，与单独使用槐耳清膏相比，4-PBA联合槐耳清膏能更有效地降低肝癌细胞中Bcl-2蛋白水平而上调Bax蛋白的表达，使Bcl-2/Bax下降(P<0.05)(图5E、F、G)，促进肝癌细胞凋亡。

3 讨论

低氧、营养缺乏、氧化应激和许多其他刺激都能导致错误折叠的蛋白质在内质网(endoplasmic reticulum，ER)中聚集，从而诱发细胞产生ERS。为了提高蛋白质的折叠能力，ER将启动一系列的适应过程，此过程被称为未折叠的蛋白质反应(unfolded protein response，UPR)[7]。许多研究[8]表明ERS不仅能够促进肿瘤转移，还与癌症的其他进程密切相关[8]。本研究中，产生ERS的肝癌细胞与ERS被抑制的肝癌细胞相比，细胞活力更强，细胞凋亡减少。

越来越多的研究表明，抗癌药物在杀伤肿瘤的同时可诱导肿瘤细胞发生ERS。如紫杉醇、阿霉素和西妥昔单抗[9]均能有效地诱导ERS的发生，激活UPR。持续的UPR信号能够促进肿瘤生长、转移和对化疗耐药[4]。然而在一些肿瘤中，持续和严重的ERS可以导致细胞发生免疫原性死亡[10]，例如硼替佐米能够诱导慢性ERS并使塞来昔布杀死致敏的胶质母细胞瘤细胞[11]。但关于槐耳清膏能否诱导肝癌细胞ERS的研究很少。本研究显示经槐耳清膏处理后的肝癌细胞中ERS相关蛋白GRP78、PERK和IRE1的表达增加，说明槐耳清膏可以诱发肝癌细胞ERS。

图2 槐耳清膏诱导肝癌细胞凋亡

图3 槐耳清膏诱导肝癌细胞发生ERS

图4 4-PBA抑制槐耳清膏诱导的肝癌细胞ERS

图5 抑制肝癌细胞ERS可增强槐耳清膏的抗肿瘤能力

A、B：Hep3B、HepG2细胞凋亡情况；C：Hep3B、HepG2细胞凋亡差异；D：Hep3B、HepG2细胞活力的差异；E、F：Western blot法检测Hep3B、HepG2B细胞Bcl-2与Bax的表达；G：Hep3B和HepG2细胞Bcl-2/Bax的差异；1：对照组；2：4-PBA组；3：槐耳清膏组；4：槐耳清膏+4-PBA组；与对照组比较：*P<0.05；与槐耳清膏组比较：#P<0.05

4-PBA已被用于临床中尿素循环障碍的治疗且无明显毒副作用[11]，且4-PBA能够抑制细胞ERS的发生。本研究表明槐耳清膏与4-PBA联合使用能够抑制槐耳清膏诱导的肝癌细胞ERS，减轻ERS对肿瘤治疗的不利影响。

本研究在验证槐耳清膏具有抗肿瘤作用的同时也提示槐耳清膏可诱导肝癌细胞发生ERS，导致槐耳清膏的作用下降。4-PBA能够有效抑制ERS的发生，与槐耳清膏联合使用降低了肝癌细胞内ERS水平，上调细胞内Bax蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达，降低细胞内Bcl-2/Bax的比值，使槐耳清膏抑制肝癌细胞活力、诱导肝癌细胞凋亡的作用增强。4-PBA联合槐耳清膏与单独使用槐耳清膏相比具有更明显地抗肿瘤作用，可能为肝癌的治疗提供新的思路。