海参肌原纤维蛋白在羟自由基生成体系中的结构变化

贺宝玉，董秀芳，奚 倩，白 颖，隋 悦，启 航*

（1 大连工业大学食品学院 辽宁大连116034 2 国家海洋食品工程技术研究中心 辽宁大连116034 3 塔里木大学生命科学学院 新疆阿拉尔843300）

海参是世界海八珍之首，其营养价值极高，几千年来在中国和西方国家均作为滋补性食品食用。中国2017年海参的产量已达到22 万t[1]。海参在加工储藏过程中通常会出现质量品质下降等问题，而氧化是导致该问题的重要原因。肌肉蛋白质的氧化会引起蛋白质的交联聚集，使得其结构功能发生改变，营养成分降低，进而对其制品的外观特性、功能特性、营养和感官特性产生较大的影响。

活性氧（Reactive Oxygen species，ROS），具有较高的化学反应活性，可使细胞结构和功能受到损坏，导致海参发生氧化损伤[2-4]。它的氧化涉及很多过程，如过氧化物、金属离子和肌红蛋白的氧化过程，它是很多水产品及其制品蛋白质氧化的主要引发剂。蛋白质氧化指的是蛋白质的共价修饰，引发蛋白质氧化的途径有很多种，如金属催化氧化，肌红蛋白引发的氧化，脂质氧化体系引发的氧化[5]。另外，温度、光照、辐照、水分活度等其它因素的存在也会对蛋白质和氨基酸的氧化产生影响。根据其氧化途径可将蛋白质氧化分成2 种：一种是蛋白质和活性氧（ROS）直接反应，另一种是蛋白质与氧化应激的二级副产物反应[6-8]。蛋白质发生氧化时，其天然结构和完整性都会发生变化，这些变化不仅会影响产品品质，而且还会发生许多物理和化学变化，包括氨基酸的破坏，酶活性丧失，蛋白质消化率降低等[9-11]。前期研究发现，海参在加热处理过程中产生的自由基类物质对海参的品质有一定的影响。董秀芳等[12]研究发现，甘草、迷迭香、竹叶和绿茶等天然提取物与VC 作用相似，在低浓度时对模型有促进氧化作用，高浓度时有抗氧化作用，且抗氧化的能力较为相近。冯丁丁等[13]研究发现海参在热加工过程中会产生脂质类自由基，且自由基生成量与加热温度、加热时间呈正相关关系。本研究以海参肌原纤维蛋白（Myofibrillar protein，MFP）为研究对象，检测氧化对其化学结构指标以及微观结构产生的影响，阐明海参蛋白质在不同氧化体系中的生物化学及其微观结构变化，以期为控制海参加工过程中由氧化引起的品质变化提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料 海参（120～160 g），购自大连市刘家桥市场。

1.1.2 主要试剂 2，4-二硝基苯肼（DNPH）、5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox，水溶性维生素）、N，N-亚甲基双丙烯酰胺，美国Sigma-aldrich 公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、溴酚蓝，生工生物工程（上海）股份有限公司，其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 主要仪器与设备

AE-6500 ATTO 垂直电泳槽、AE-8135 ATTO 电泳仪电源，日本ATTO 株式会社；MFCHEMIBIS 2.0 凝胶成像仪，以色列DNR 成像系统有限公司；A810-03 冷场发射扫描电子显微镜、F-2700 型荧光分光光度计，日本日立高新技术公司；M20 型酶标定量测定仪，瑞士Tecan Infinite公司；T25 数显匀浆机，德国IKA 集团。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理 将新鲜海参宰杀去脏，并将剥离出的海参筋于-80 ℃冰箱中储存备用。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取 称取4 g 海参筋，按照1∶5 的料液比加入50 mmol/L 的磷酸盐缓冲液（pH 6.0），匀浆（8 000 r/min，2 min），离心（10 000×g，4 ℃，15 min），弃去上清液。将所得沉淀重复上述操作2 次。所得沉淀按照1∶4 的比例加入0.6 mol/L KCl，高速匀浆（8 000 r/min，1 min），离心（10 000×g，4 ℃，15 min），取沉淀后再按照1∶4 的料液比加入0.6 mol/L NaCl，高速匀浆 （8 000 r/min，1 min），所得溶液经两层纱布过滤，取上清液，离心（10 000×g，4 ℃，15 min），所得沉淀即为肌原纤维蛋白。将肌原纤维蛋白存放在管中，置于冰上,储存在4 ℃的环境中。

1.3.3 双缩脲法检测蛋白质含量 取肌原纤维蛋白沉淀0.04 g，加入0.96 mL 水，剧烈振荡。按照1∶4 的料液比加入双缩脲试剂，静置30 min 后，检测波长540 nm 处的吸光值。每组3 个平行。用牛血清蛋白制得的标准曲线计算蛋白质含量。

1.3.4 肌原纤维蛋白的氧化 将肌原纤维蛋白悬浮液 （20 mg/mL）在由0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L 抗坏血酸与2 种浓度的H2O2（10 mmol/L和50 mmol/L）组成的氧化系统中于4 ℃分别氧化3，6，9，12 h，加入水溶性维生素（1 mmol/L）终止氧化反应。对照组不进行氧化处理。

1.3.5 肌原纤维蛋白一级结构的测定

1.3.5.1 羰基含量的测定 用2，4-二硝基苯肼（DNPH）比色法测定样品中的羰基含量。取200 μL 肌原纤维蛋白样品加入400 μL 的DNPH（10 mmol/L），对照组加入400 μL HCl（2 mol/L），遮光反应1 h。在此期间每10 min 振荡一次。加入500 μL 20% 三氯乙酸（TCA），振荡30 s，在冰浴中静置30 min，离心（12 000×g，4 ℃，15 min），弃去上清液。加入1 mL 乙醇和乙酸乙酯（体积比1:1）的混合物洗涤3 次，每次清洗后离心（12 000×g，4 ℃，15 min）。加入250 μL 的盐酸胍（6 mol/L），混匀，37 ℃水浴15 min 后离心（12 000×g，15 min），取上清。检测波长370 nm 处的吸光值。使用22 000 L·mol-1cm-1的摩尔吸光系数计算羰基含量。

1.3.5.2 游离巯基含量的测定 使用5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）方法测定各组肌原纤维蛋白样品的游离巯基含量。将肌原纤维蛋白样品溶解在三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸（Tris-Gly）-8 mol/L 尿素溶液中，并与DTNB 试剂在37 ℃下孵育30 min，检测波长412 nm 处的吸光值。试剂空白和样品空白同时测量。使用13 600 L·mol-1cm-1的摩尔吸光系数计算游离巯基含量。

1.3.5.3 游离氨基含量的测定 游离氨基含量的测定参考Habeeb[14]的方法。将50 μL 肌原纤维蛋白样品溶解在500 μL 含有1%十二烷基硫酸钠（SDS）的0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 8.2）中，然后溶 解 于250 μL 0.01% 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）。避光条件下，50 ℃反应30 min。用500 μL 0.1 mol/L 亚硫酸钠终止反应，室温放置15 min。读取波长420 nm 处的吸光度，用L-亮氨酸（1% SDS）制得的标准曲线用于游离氨基含量计算。

1.3.6 色氨酸的测定 将肌原纤维蛋白样品用含0.6 mol/L NaCl 的PBS （pH 6.25）稀释到10 mg/mL，在激发波长283 nm 处记录在300～400 nm 的发射光谱，激发和发射的狭缝宽度设定为5 nm，并以500 nm/min 的速率收集数据。为消除干扰，在相同条件下，将溶剂发射光谱从光谱中扣除。光谱测量数据在3 次试验中取平均值。

1.3.7 肌原纤维蛋白交联聚集情况的测定 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE）方法，使用5%浓缩胶和10%分离胶对蛋白质的交联聚集情况进行分析。将肌原纤维蛋白样品进行离心（4 ℃，12 000×g，15 min）。取上清液与上样缓冲液（含有或不含有5% β-巯基乙醇）按照体积比1∶1 的比例混合并煮沸5 min。上样量为40 μg。取出胶后，用含有0.05%的考马斯亮蓝R-250 染色。采用脱色液（含50%无水乙醇，9%冰醋酸）脱色，最后用凝胶成像仪的可见光成像系统成像。

1.3.8 肌原纤维蛋白微观结构的测定 将肌原纤维蛋白溶液（40 mg/mL）注射至样品台，液氮冷冻后，转移到冷场电镜冷冻隧道的真空室内于-90℃升华5 min。用氩气喷涂90 s，将喷涂后的样品放回扫描电镜冷台，在15 kV 下扫描，并于放大1 500 倍下，观察样品的微观结构。

1.3.9 数据统计 试验数据以3 个平行组数据的平均值表示，并且计算标准差；用SPSS 软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示数据具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中羰基含量的变化

如图1所示，未氧化的肌原纤维蛋白的羰基含量为（3.15±0.17）nmol/mg 蛋白。当H2O2浓度为10 mmol/L 时，羰基含量在3 h 时显著升高，达到最高值（4.31±0.32）nmol/mg 蛋白，与对照组相比增加了37%，随着氧化时间的增加，羰基含量开始减少，12 h 时下降至 （2.93±0.06）nmol/mg 蛋白；当H2O2浓度为50 mmol/L 时，羰基含量在3 h时出现了减小的趋势，与对照组相比下降了22%，在6，9 h 时保持在较为稳定的状态，直至12 h 羰基含量显著增加，与对照组相比增加了25%。当氧化时间为3，6，9 h 时，H2O2浓度为10 mmol/L 与浓度为50 mmol/L 相比生成的羰基含量较多，到达12 h 时恰好相反。在剧烈氧化的条件下，生成的羰基加速了亲和物质的反应，从而使羰基含量减少[15]。肌原纤维蛋白样品的氧化将降低羰基含量，同时氨基酸侧链残基的氧化和外源氨基的引入将增加羰基含量。Li 等[16]发现将鲤鱼肌原纤维蛋白暴露在羟自由基氧化体系中时，随着H2O2浓度的增加，羰基含量逐渐增加，与本试验结果一致。

2.2 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中巯基含量的变化

肌原纤维蛋白样品暴露于羟自由基氧化系统时，游离巯基含量降低。如图2所示，未氧化的肌原纤维蛋白样品的游离巯基含量为（12.17±0.54）μmol/g 蛋白。肌原纤维蛋白样品的游离巯基含量随着氧化时间的延长，整体都呈下降趋势，且在3 h 和6 h 时下降程度剧烈，随后呈现略微下降的趋势。氧化12 h 后，游离巯基含量分别下降40.25%和45.44%（P＜0.05）。任意氧化时间中，置于50 mmol/L H2O2的肌原纤维蛋白样品的游离巯基含量与置于10 mmol/L H2O2的样品的巯基含量相比较高。肌原纤维蛋白富含巯基基团，氧化会破坏肌原纤维蛋白的空间结构，暴露更多的巯基，并被氧化成二硫键，从而使蛋白质发生交联聚合[17]，或者巯基进一步被氧化成磺酸或其它氧化产物，导致巯基含量降低。Wang 等[18]研究了鲤鱼冻藏和加热后的肌原纤维蛋白巯基的变化情况，结果显示，加热后的肌原纤维蛋白样品更易受到氧化，而且随着加热温度的提高，巯基含量逐渐减少。该结果与本研究得到的结果一致。

2.3 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中游离氨基含量的变化

如图3所示，未氧化的肌原纤维蛋白样品游离氨基的含量为（2.53±0.17）μmol/g 蛋白。当H2O2的浓度为10 mmol/L 时，游离氨基的降低程度无显著性差异。氧化时间为12 h 时，与未氧化的样品相比，氧化的肌原纤维蛋白的游离氨基含量仅下降6.36%。当H2O2浓度增加到50 mmol/L 时，游离氨基含量随着氧化时间的增加呈现显著下降的趋势。与未氧化的肌原纤维蛋白样品相比，6 h 时游离氨基含量下降程度最为剧烈，为（0.54±0.13）μmol/g 蛋白，与对照组相比下降了79%。随着氧化时间的增加，游离氨基的含量显示出略微增加的趋势，但与对照组相比，氧化时间为12 h 时，样品的游离氨含量降低了65.25%。氧化过程中生成的羰基可与氨基共价结合以进行羰基化反应，进一步降低游离氨基的含量[19]。Chen 等[20]研究了猪肉肌原纤维蛋白在氧化前、后的物理化学结构变化，结果显示，游离氨基的含量随着氧化剂浓度的增加发生显著的下降，这与本研究得到的结果一致。

图1 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中羰基含量的变化Fig.1 Changes of carbonyl contents of sea cucumber myofibrillar protein in different hydroxyl radical oxidation systems

图2 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中游离巯基含量的变化Fig.2 Changes of free sulfhydryl contents of sea cucumber myofibrillar proteins in different hydroxyl radical oxidation systems

图3 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中游离氨基含量的变化Fig.3 Changes of free amino contents of sea cucumber myofibrillar protein in different hydroxyl radical oxidation systems

2.4 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中内源色氨酸的变化

从图4中可以看出，在两种羟自由基氧化体系中，随着氧化时间的增加，肌原纤维蛋白样品色氨酸的荧光强度均发生了显著降低。当肌原纤维蛋白样品暴露于H2O2浓度为10 mmol/L 和50 mmol/L 的羟自由基基氧化系统时，与对照样品相比，氧化时间为12 h 的色氨酸荧光强度分别降低了39%和40%。Cao 等[21]研究发现，未经氧化的猪肌原纤维蛋白与经过氧化的样品相比，色氨酸荧光强度显著降低。说明当蛋白质处于折叠状态时，色氨酸残基主要位于蛋白质内核的疏水环境中，此时被激发的色氨酸具有较高的荧光强度；当蛋白质部分或者完全展开时，色氨酸暴露于溶剂的极性环境中，使蛋白质的荧光强度降低。

2.5 海参在不同羟自由基氧化体系中的蛋白质氧化情况

从图5中可以清楚地看出4 个主要的条带：分别是上样孔位置条带 （Ⅰ）、肌球蛋白重链（MHC）、副肌球蛋白 （Paramyosin）、肌动蛋白（Actin）。由非还原条件下（未加入β-巯基乙醇）的电泳图谱可知，随着氧化时间的延长，蛋白质聚集的程度增加，12 h 时，蛋白质在上样孔附近聚集量最大；在还原条件下（加入β-巯基乙醇）的样品，蛋白质的聚合程度较非还原条件下的样品减少，MHC 条带加深，说明肌原纤维蛋白的聚集是由于二硫键的形成而引起的，该结果与孙悦等[22]报道的巯基容易受到羟自由基攻击而转化成分子内或者分子间二硫键，使蛋白发生交联聚合的结果相一致。

图4 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中内源色氨酸的变化Fig.4 Changes of tryptophan in different hydroxyl radical oxidation systems of sea cucumber myofibrillar protein

图5 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中蛋白质的聚集情况Fig.5 Protein aggregation of sea cucumber myofibrillar protein in different hydroxyl radical oxidation systems

2.6 海参在不同羟自由基氧化体系中微观结构的变化

从图6中可以看出，未经过氧化处理的肌原纤维蛋白样品的结构较为疏松，具有较粗的网络和较大的空隙或空腔。随着氧化时间的增加，暴露于10 mmol/L 和50 mmol/L 的羟自由基氧化体系中的肌原纤维蛋白样品随着氧化时间的增加结构均变得致密，氧化12 h 时，结构最致密，说明氧化时间越长，氧化程度越剧烈，蛋白质的铰链程度越高，整体结构越致密。从图5的蛋白质条带中也可以看出，氧化可能促进了蛋白质的交联聚集，从而使其微观结构变得紧密。Sun 等[23]通过观察添加不同水平的氧化剂处理后的猪肉肌原纤维微观结构，发现氧化剂可导致丝状卷曲结构出现，氧化肌原纤维表面结构的形成归因于氨基酸侧链的修饰，使蛋白质在分子内和分子间产生交联和聚集。

图6 海参肌原纤维蛋白在不同羟自由基氧化体系中微观结构的变化Fig.6 Microstructural changes of sea cucumber myofibrillar proteins in different hydroxyl radical oxidation systems

3 结论

当海参肌原纤维蛋白于2 种不同浓度的羟自由基氧化体系（0.01 mol/L FeCl3/0.1 mol/L VC/10 mmol/L H2O2和0.01 mol/L FeCl3/0.1 mol/L VC/50 mmol/L H2O2）中氧化不同时间（3，6，9，12 h）时，其生物化学和微观结构均会发生改变，进而导致海参品质发生变化。海参肌原纤维蛋白发生了以二硫键形成为主要因素的蛋白质聚集，该结果对控制加工过程中海参体内发生的氧化反应，从而控制产品质量提供一定的参考依据。