基于激光辅助顶空固相微萃取技术分析甲鱼油挥发性成分

宋恭帅，赵巧灵，朱勤超，张晓頔，王萍亚，薛 静，陈 康，王宏海，戴志远，2，沈 清，2*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012 3 舟山市食品药品检验检测研究院 浙江舟山316012）

中华鳖，俗称甲鱼，是一种珍贵的水产经济动物[1]，富含维生素、蛋白质及人体所需的必要微量元素等，对心脑血管疾病有很好的防控作用[2]，是中国传统的滋补佳品。近年来，由于甲鱼养殖业的迅猛发展，多种甲鱼加工产品不断面市，主要包括酒、胶囊等保健产品，冷冻及真空包装的即食产品等[3]。随着甲鱼加工产品的多元化发展，大量甲鱼内脏等加工副产物被丢弃，造成了资源浪费及环境污染。甲鱼油的开发对甲鱼加工副产物的高值化利用具有重要意义。甲鱼油中富含n-3 系多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA），主要是EPA 和DHA，具有抗血小板凝聚、降血脂、延缓血栓形成等生理活性功能，是开发高级保健食品的优质原料[1-2]。粗制甲鱼油中含有大量杂质，包括游离脂肪酸（FFA）、磷脂、类固醇、脂溶色素、蛋白质等，尤其是甲鱼油中PUFA 氧化降解和非脂肪成分酸败产生的腥臭味物质，具有一定毒害作用[4-5]。油脂中的不良气味成分易降低其生理活性功能及感官特性，从而严重影响产品品质[6-7]。在甲鱼油生产加工时，用一种高效检测方法分析其挥发性成分变化具有重要意义。

挥发性成分分析技术主要包括成分收集与分析。目前，水产加工制品中挥发性成分的收集方法有动态顶空萃取法（DHE）[8]、超临界流体萃取法（SFE）[9]、同时蒸馏萃取法（SDE）[10]等。这些方法普遍费时、费力，且不适合处理大批量样品。相比之下，顶空固相微萃取法（HS-SPME）具有操作简便、无溶剂、选择性好、适用性强等特点，应用更为广泛[11]。然而，HS-SPME 仍存在一些问题，如萃取时间、萃取温度的控制、萃取头使用寿命等[12]。激光（Laser）是一种高质量的光源，具有高亮度、高方向性、高单色性及高相干性等特性，被广泛应用于工业产生中[13]。Filik 等[14]利用激光拉曼光谱在波长514.5 nm 条件下分析含氢非晶碳膜构造。Norris等[15]综述了基质辅助激光解吸/电离成像质谱法研究生物和临床组织标本。

本研究充分考虑了HS-SPME 的不足与激光辐照的优点，旨在开发一种快速、高效的激光照射解吸（LID）方法，取代传统的热辅助解吸（HAD）方法，优化工艺参数（激光照射功率、照射时间、样品含量），以提高甲鱼油挥发性化合物的释放，并通过顶空固相微萃取-气质联用技术 （HS-SPMEGC/MS）鉴定甲鱼油中的挥发性成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲鱼油，由浙江省水产质量检测中心提供。

1.2 仪器与设备

50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂层萃取头，美国Supelco 公司；Trace GC Ultra 气相色谱与DSQ Ⅱ质谱联用仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；二极管激光器，长春镭仕光电科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 顶空固相微萃取条件 将老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS 涂层萃取头插入进样瓶顶空部分，待吸附反应结束，取出萃取头并插入GC 进样口，250 ℃解吸3 min。

1.3.1.1 激光照射解吸 利用二极管激光器对甲鱼油样品进行照射，其最长工作波长为450 nm，最大允许输出功率为50 W。激光照射甲鱼油的同时，萃取头对挥发出来的物质进行吸附。分别考察激光照射功率、照射时间、样品含量这3 个单因素对甲鱼油中主要挥发性成分萃取效果的影响。试验过程如下：设置不同照射功率（6，8，10，12，14 W）、不同照射时间（3，4，5，6，7 min）和不同样品添加量（2，3，4，5，6 g），并参照前期研究的关于鱼油中主体挥发性成分[16]，以己醛、壬醛、1-戊烯-3-醇、庚醛和戊醛的峰面积作为评价指标。通过单因素试验，确定各因素最佳值。

1.3.1.2 热辅助解吸 参照Fratini 等[17]报道的关于热辅助解吸结合顶空固相微萃取 （HAD-HSSPME）的方法，具体操作方法如下：称取3 g 样品置于15 mL 顶空进样瓶中，并将老化好的萃取头插入进样瓶顶空部分，80 ℃下吸附30 min。

1.3.2 GC-MS 检测条件 GC 条件：色谱柱为TR-35 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯氦气；进样口温度250 ℃，不分流进样；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升至90℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持7 min。

MS 条件：离子源温度200 ℃；电子离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；检测器温度280 ℃；质量扫描范围m/z 30～500。

1.3.3 化合物分析 通过NIST 2.0 谱库做自动检索确认分析，且仅当正反匹配度（SI/RSI）均大于800 （最大值为1 000）的鉴定结果才予以保留。采用峰面积归一化法求得各挥发性成分在样品中的相对百分含量[18]。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 激光照射功率对甲鱼油中挥发性成分萃取效果的影响 在激光照射过程中，照射功率的大小与被照物体表面温度升高速率快慢密切相关。陈国星等[19]通过不同激光功率对不锈钢表面清洗效果影响的研究，发现随着功率的增大，激光清洗效果明显提高。如图1所示，壬醛、己醛、庚醛、1-戊烯-3-醇、戊醛的峰面积均随照射功率的升高先增大而后减小，其中以壬醛的变化趋势最为显著。在油脂中，醛类化合物是不良风味的重要组成成分，主要来自不饱和脂肪酸的氧化降解，且醛类的感觉阈值一般很低，对整体风味贡献大[20]。当功率为10 W 时，5 种主要挥发性成分的峰面积最大，说明该功率下，萃取效果最佳；当激光功率过低时，甲鱼油中的挥发性成分不能完全挥发出来；当功率过高时，导致油表面温度过高，致使脂肪酸发生氧化酸败从而产生新的挥发性物质。故最佳照射功率为10 W。

图1 照射功率对挥发性成分萃取率的影响Fig.1 The effect of laser power on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

2.1.2 激光照射时间对甲鱼油中挥发性成分萃取效果的影响 在相同激光功率条件下，照射时间越长，样品吸收能量越多，温度变化越大。李士斌等[21]研究了激光照射时长对激光破岩的影响，结果表明，在保证其它试验参数不变的前提下，钻孔深度和孔直径随照射时长的增加而逐渐增加。由图2可知，在3～5 min 内5 种特征挥发性成分的峰面积均随时间延长而增大，5 min 时各物质峰面积达到最大值。当照射时间超过5 min 时，各物质的峰面积均逐渐减小，这可能是由于甲鱼油表面温度过高，使部分油脂被氧化而发生异构化等原因所致。因此，最佳照射时间为5 min。

2.1.3 样品添加量对甲鱼油中挥发性成分萃取效果的影响 在相同激光功率和照射时间下，样品添加量越大，温度升高越慢，挥发性成分逸出速率越小。由图3可知，己醛、庚醛、1-戊烯-3-醇、壬醛的峰面积受添加量影响较大，样品添加量为2～3 g 时，这4 种挥发性成分的峰面积均随添加量增大而逐渐变大；当添加量为3 g 时，峰面积均达到最大值，之后峰面积逐渐变小。而戊醛的峰面积则几乎没什么变化，主要原因是戊醛在甲鱼油中的含量本身就很低。故选择3 g 为最佳样品添加量。

2.2 甲鱼油中挥发性成分测定

采用LID-HS-SPME-GC/MS，在最优操作参数条件下，即激光功率10 W、照射时间5 min、样品添加量3 g，测定甲鱼油中挥发性成分，结果如表1所示。甲鱼油中共鉴定出53 种挥发性物质，包括醛类11 种、醇类10 种、酮类11 种、烃类16种及其它类5 种。挥发性物质的相对含量与样品整体风味特征之间无直接关系，其对整体风味的贡献是由其在风味体系中的浓度和感觉阈值共同决定[25]。

图2 照射时间对挥发性成分萃取率的影响Fig.2 The effect of irradiation time on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

图3 样品添加量对挥发性成分萃取率的影响Fig.3 The effect of sample volume on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

在油脂中，醛类化合物具有脂肪味、鱼腥味、青草味等，主要来自脂质氧化降解。一般地，醛类的感觉阈值比其它化合物低，且具有气味加和作用，微量存在时也会对整体风味产生较大的影响[26]。甲鱼油中含有10 种脂肪醛（己醛、戊醛、（E）-2-己烯醛、壬醛、庚醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、辛醛、癸醛、1-十二碳烯-3-醛、2-乙基丁烯醛）及1种芳香醛（对甲基苯甲醛），这些物质可能是由于不饱和脂肪酸氧化降解后所形成的过氧化物的裂解产生的，其中，己醛的含量最高（1.36%）。己醛是亚油酸氧化酸败的重要特征产物，具有鱼腥味、青草味，且感官阈值低，仅为4.5 μg/kg[27]；壬醛含量次之（0.83%），其是油酸的氧化产物，具有脂肪味、鱼腥味，其阈值为1 μg/kg。己醛、壬醛含量越高，甲鱼油鱼腥味越强烈。

表1 不同提取方法制备甲鱼油样品中挥发性成分变化Table 1 Volatile flavor profiles of turtle oil extracted with different methods

醇类化合物主要是由醛类、糖类及氨基酸的氧化还原而产生，也可是源于脂肪酸二级氢过氧化物的降解或羰基化合物还原[28]。醇类可分为饱和与不饱和醇类，因不饱和醇类的感觉阈值更低，其对整体风味的贡献更大[29]。1-戊烯-3-醇是亚油酸的氢过氧化物降解产生，是主要的不饱和醇类化合物，具有鱼腥味等特征风味[24]。甲鱼油中1-戊烯-3-醇含量为1.23%，且阈值为400 μg/kg，对整体风味具有一定贡献。

酮类化合物的产生机制与醛、醇类化合物类似，主要通过油脂中氢过氧化物热氧化降解产生[30]。甲鱼油中酮类化合物总含量占比最少，但其感觉阈值较低，对鱼油整体风味的影响仍较大。在检测到的化合物中，2-壬酮、2-十一酮、2-癸酮、2-辛酮和2-庚酮的感觉阈值，分别为5.5，7，35，50.3及140 μg/kg，其中，2-辛酮的含量最高，为0.19%，对甲鱼油整体风味的贡献更大。此外，这些酮类化合物具有脂香味、水果味、花香味等。

烃类化合物是甲鱼油中含量最高的挥发性物质，占64.98%，其主要是由于脂肪酸烷基自由基的均裂产生。各种烃类（C8-C20）的感觉阈值通常较高，对鱼油整体风味几乎没有作用。另外，部分挥发性小分子含氧杂环化合物，如2，5-二甲基呋喃、环氧柏木烷可能对整体风味有辅助作用。2，5-二甲基呋喃具有温和的豆香味，而环氧柏木烷具有甘甜木香[31]。

（续表1）

2.3 LID 与HAD 方法对比

为了评价LID-HS-SPME-GC/MS 的萃取性能，与传统的HAD-HS-SPME-GC/MS 进行对比。HAD-HS-SPME-GC/MS 的操作参数如下：加热温度80 ℃、萃取时间30 min、样品添加量3 g。经由LID 和HAD 作用后甲鱼油中挥发性成分的总离子流图如图1所示，将各个色谱峰所对应的质谱在NIST 图库进行检索并结合参考文献，确定甲鱼油中挥发性成分的种类，再采用面积归一化法计算出每一种成分在样品中的相对含量，结果如表1所示。

由图4可知，经LID 处理后峰数多于HAD，且峰强度更大。从表1可知，在LID 作用下，甲鱼油中共检测到53 种挥发性化合物；而经由HAD处理后，则检测到50 种化合物。2，6，7-三甲基癸烷、十四烷、肉豆蔻酸异丙酯未检出，从总离子流图中可以看出，该3 种物质的出峰时间主要集中在36.71～39.65 min。此外，甲鱼油中重要的挥发性成分，包括壬醛、己醛、庚醛、1-戊烯-3-醇、己醇、2-壬酮、2-癸酮、2-辛酮等在2 种方法作用下均有检测到，但经LID 处理后的样品中各物质的相对含量均高于被HAD 处理的样品。

对比结果表明，由2 种方法处理后，甲鱼油中的挥发性成分均能被有效地检测到。但是LID 的萃取效果明显优于HAD，原因在于该方法作用下，甲鱼油中检出的挥发性物质种类更多、相对含量更高，且操作时间更短，仅需5 min，而HAD 则需30 min。这说明具有高能量、高密集度、低发散性等优点的激光能有效地在短时间内加速甲鱼油中挥发性物质的挥发。

图4 激光解吸法（a）与热辅助解吸法（b）作用下甲鱼油挥发性成分总离子流图Fig.4 The gas chromatograms of volatiles of turtle oil obtained by techniques of LID （a）and HAD （b）

2.4 激光照射作用机理

激光对甲鱼油照射过程中，甲鱼油表面吸收大量激光能量。由于激光的瞬时热效应，使甲鱼油中所含的挥发性成分受热向外膨胀，相当于给挥发性成分粒子一个向上的牵引力，当牵引力足够大时，挥发性成分粒子就逸出油面，聚集在顶空瓶上端，再通过萃取头吸附。在一定范围内，激光照射功率越大，油表面温度升高越快，挥发性成分挥发速率越快，从而使萃取效果越好，挥发性成分含量也就越高。

2.5 方法可行性验证

为验证LID-HS-SPME-GC/MS 方法的可行性，主要从灵敏度、精密度、回收率等方面进行评价。灵敏度评价包括检出限和定量限的测定，检测限是指在规定的试验条件下，分析方法所能检出样品中被测组分的最低浓度；定量限是指分析方法可定量测定样品中待测组分的最低浓度[32]。精密度测定就是在相同检测条件下做重复试验，并用相对标准偏差表示，相对标准偏差（RSD，%）=标准偏差/被测组分含量的算术平均值×100，一般测定日内精密度和日间精密度。回收率可用于判断该方法的准确度。

采用己醛、壬醛、1-戊烯-3-醇、庚醛、己醛、2-十一酮、戊醛、2-辛酮这8 种甲鱼油中特征风味化合物作为该分析方法可行性验证指标，结果如表2所示。由表2可知，该分析方法的检出限和定量限分别为0.13～0.71 ng/g，0.41～1.86 ng/g，这说明该方法有良好的灵敏度。测定日内与日间精密度时，设置3 个浓度水平，每个水平检测6 次[33]。甲鱼油中所有特征化合物的日内精密度的RSD 均低于14.11%，而日间精密度的RSD 在6.97%～13.64%。一般分析方法精密度的RSD ＜20%，则表明该方法精密度良好[34]。此外，各挥发性物质的回收率在95.6%～104.0%。该结果验证了LID-HS-SPMEGC/MS 方法是灵敏、精密和高效的，且在甲鱼油中挥发性成分快速分析方面具有良好的性能。

表2 从检出限、定量限、精密度及回收率评价LID-HS-SPME-GC/MS 方法的可行性Table 2 Method validation of LID-HS-SPME-GC/MS device in terms of detection and quantification limits，accuracy and recovery

3 结论

LID-HS-SPME-GC/MS 分析方法具有良好的灵敏度、精密度及回收率，且在分析鉴定甲鱼油中挥发性成分时具有高效性。与传统的加热辅助顶空固相微萃取-气质联用 （HAD-HS-SPME-GC/MS）相比，LID-HS-SPME-GC/MS 能在更短的萃取时间内检测到更多挥发性物质，且含量更高。说明该方法可用于甲鱼油中挥发性成分的快速且全面的检测分析。之后，本课题组将进一步优化该新型、高效的分析方法，并应用到其它液体样品的挥发性成分分析中。