先天性肌强直一家系的临床与基因分析

曹小丽 覃秋燕 黄 文

广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021

先天性肌强直(myotonia congenita，MC)作为一种罕见的遗传性骨骼肌离子通道肌病首先由EULENBERG提出[1]，发病率仅为(0.3～0.6)/10万[2]。该病主要特点为肌强直及短暂无力，属常染色体显性或隐性遗传，由SCN4A或CLCN1基因突变所致[3-4]，两种基因突变所致的疾病类型有广泛的表型重叠，临床变异性较大[5-7]。其中氯离子通道(chloride channel 1，CLCN1)基因为特异表达于骨骼肌的电压门控通道，位于7q35区，大小为36 kb，有23个外显子，共988个氨基酸位点，编码CLCN1蛋白。由于CLC1蛋白并无S4电压感受器，仅有两个三角形结构形成同源二聚体结构，有两个狭小孔道呈双螺旋对称排列于二聚体中心，每个亚基由18个α螺旋组成，N末端与C末端的多肽结构类似，且均倾斜于膜内，但膜内走向相反，形成特殊的相互围绕的假二倍对称的独立Cl-通道孔洞，因此其单通道电导虽仅1-1.5pS，但已达到静息状态下总膜电导的70%～85%[5]，因此任何原因引起单个通道的结构变化均可显著影响蛋白功能。一般认为CLCN1基因突变所致的先天性肌强直临床表现型可分为显性(Thomsen)和隐性(Becker)两种，显性遗传由突变位点所在亚基对复合突变位点或野生型通道的显性负效应实现，氯电流阻断试验中可诱导激活曲线向正性膜电位漂移，使整个氯离子电流电导下降，出现肌强直；隐性遗传则是由于突变引起的功能丧失效应所致，如开放概率降低，单通道电导降低或生化稳定性变化，但均不会显著影响氯离子通道二聚体结构的形成或功能，这类突变体在肌强直药物试验中阻断50%的生理性氯电流亦不能产生强直性活动，因此无临床表现或仅有轻微损害[8]。

CLCN1基因目前已有200多个突变位点被发现[9-10]，突变位点可出现于基因全长，其中8号外显子为突变热点，有插入、缺失、剪切、移码等形式，80多个被证实为功能性突变。SUN等[11]发现30%～ 60%先天性肌强直患者的临床诊断结论与基因检测及致病性分析结果相悖，提示作用机制复杂，其发病机制仍不清楚。本研究对疑似先天性肌强直的一家系进行了临床和CLCN1基因突变分析，试图为该病发病机制研究提供新的资料，提高对这一临床罕见病的认识。

1 对象与方法

1．1临床资料先证者：男，24岁，汉族，祖籍广西，主诉“双手握拳后张开困难10余年，加重半年”于2019-01来广西医科大学第一附属医院就诊。患者足月顺产，自幼智能及体格发育与同龄人无差异。自8岁起发现双手紧握拳后难以松开，上肢平举时伸直费力，长时间维持相同姿势后再活动起动困难，反复活动后可缓解，天气转冷时发作无变化，无肌肉疼痛、萎缩及肥大，无感觉异常，叩击双侧上臂未见肌球，智能正常。体格检查：高级神经活动及脑神经未发现异常，浅感觉无减退，四肢肌力肌张力正常，未见明显萎缩或肥大，腱反射对称，病理征阴性。辅助检查：电解质正常，肌酸激酶245 U/L(参考值：26～140 U/L)，血乳酸、甲功、电解质和颅脑MRI+MRA检查未见异常。电生理检测：针极肌电图提示所检肌肉肌强直放电，未见神经源性及肌源性损害。

家族史：患者就诊6个月内完成家系调查，父系三代共5人患病，患者爷爷、姑姑、大姐及父亲有类似症状，其中(I1)爷爷已去世，(II3)父亲自幼有类似症状，表现轻微，不影响日常生活，患病姑姑(II4)症状与父亲相似，未婚育；大姐(III2)27岁，自幼有乏力、手足僵硬不适，随年龄增长上述症状逐渐减轻。家系图谱见图1。

1．2研究方法

1．2．1 高通量外显子测序与Sanger测序验证：在征得受试者同意并签署书面知情同意书后，空腹采集先证者外周静脉血5 mL，抽提基因组DNA，磁珠纯化法处理DNA并PCR扩增，扩增后连接接头序列，用TruSight One Sequencing Panel(illumina Inc，USA)两次捕获并纯化，再次PCR扩增和纯化后将获得的文库在MiSeq测序仪(illumina Inc，USA)对4 811个与临床疾病相关的基因外显子区进行测序。根据人类基因突变数据库(human gene mutation database，HGMD Professional)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、Gene Tests网站 (www.genetests.org)、Illumina，最终纳入候选基因。寻找致病突变基因并Sanger测序验证，获得突变位点后对患者家族中父母、两位姑姑、叔叔及两位姐姐进行PCR验证；同时选取本课题组标本库中50例健康人DNA样本作为对照组，利用同一引物进行PCR检测。

注：先证者，□正常表型男性，●患病女性，○正常表型女性，■患病男性图1 CLCN1基因突变所致先天性肌强直先证者家系图，父系三代中先证者爷爷父亲大姐及一位姑姑有类似症状，其他人表型正常Figure 1 Pedigree of the family with CLCN1 gene mutation-related myotonia congenita.In this family.The proband and his grandfather，father，elder sister and aunt were patients with myotonia congenita，while other family members were healthy

1．2．2 氨基酸序列保守性及突变致病性分析：运用UGENE软件进行不同物种氨基酸序列保守型分析，同时采用poly2 phen软件( http：//genetics.Bwh.Harvard.edu/pph)进行致病突变性分析。本研究经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

2 结果

2．1先证者及亲属基因检测先证者CLCN1基因(NC_000007.14)存在c.1879A>C位点突变，该突变为错义突变，导致编码氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸(p.T627P)，先证者的大姐、姑姑及父亲分别利用设计的引物进行扩增。PCR结果证实其父亲、姑姑及大姐均有同一突变，而母亲和二姐未发现该突变(图2)，利用UGENE软件对不同物种CLCN1基因编码的氨基酸序列作比较分析。根据对比分析，CLCN1基因突变位点区域所编码蛋白氨基酸序列在不同物种间保守性不高(图3，箭头示突变位点编码脯氨酸所在区域) 。

图2 先证者和其母基因检测结果，先证者存在c.1879A>C位点突变，其母未发现该位点突变Figure 2 Sanger sequencing results of the proband and his mother，heterozyous mutation CLCN1 c.1879A>C was identified in proband，while no mutation was detected in his mother

2．2治疗仅先证者及其大姐同意接受小剂量美西律(200 mg/d)治疗，并配合门诊随诊，半年后随访结果显示上述症状有所减轻。

3 讨论

本研究中先证者为幼年起病的肌强直与运动笨拙，症状主要分布于面部和上肢，叩击后可见肌球，常伴发数天肌无力症状，肌肥大不明显，肌电图示肌强直电位，肌酶不高。对患者进行了家系调查和生物信息学分析，高通量测序及Sanger验证在先证者中均发现CLCN1基因c.1879A>C突变，经验证家系中其他3名患者也存在CLCN1基因c.1879A>C突变，而健康家族成员则未发现携带该突变，家系中突变与疾病呈共分离。对照组基因检测结果排除了该位点为单核苷酸多态性位点可能，可认为CLCN1基因c.1879A>C为基因突变位点，诊断后予美西律治疗有效，符合经典先天性肌强直表现，家族中其他患者症状类似，因而诊断为先天性肌强直家系。

目前CLCN1基因突变导致肌强直的机制目前并不十分明确。IMBRICI等[12-13]分析了体外细胞表达系中多个突变位点，通过分子动力学分析发现F484L通过改变介于螺旋结构F.E232以及螺旋结构R.Y578之间的H环结构影响慢通道，引起慢通道右移；p.L198P和p.G270V则改变了慢通道的正向电位，p.V640G降低了通道的反应性，而p.G190S和L628P突变通道的行为与野生型相似，结合其他研究可认为除部分突变位点因为物理距离原因可直接改变通道结构外，氯通道跨膜结构域的同源二聚体化结构模式很可能适用于整个蛋白，因此部分突变C末端结构域虽与通道的孔道距离较远，却对通道的传导和门控特性有较大的影响，甚至会导致通道丧失正常功能；还有些突变虽不改变蛋白的拓扑结构与功能，却在其他因素共同作用下，如细胞内外PH值等影响电压门控通道的开放，导致临床出现肌强直现象[14]。c.1879A>C位于14号外显子，为错义突变，导致627位编码氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸(p.T627P)。该突变位于胱硫醚-β-合成酶蛋白合成区域1(氨基酸位点为609-668)[15-16]。已有多个突变位点与c.1879A>C在类似，氨基酸序列保守分析及致病性评分较低而临床表现为肌强直，尤其是与之相邻的突变位点L628P在电生理学表现类似野生型，而有临床的肌强直症状，推测T627P突变作用机制可能与L628P相似。在爪蟾卵母细胞和HEK293细胞中，通过分子动力学分析包括L628P在内12个CLCN1基因变异体，电流活动与野生型几乎无差别[12]。RONSTEDT等[17]以YFP及CFP融合蛋白标记，用全细胞膜片钳及单细胞荧光标记方法，分析了四种致病突变Q43R、S70L、Y137D和Q160H，这一系列突变在不同物种中氨基酸序列保守性和致病性分析评分并不高，但前3个突变尤其是Q43R/Q43R同二聚体或WT/Q43R异二聚体亚基对膜表面门控通道的影响远大于野生型，影响了通道整体电流幅度，但对单个通道电流及氯离子通道的结构无影响，提示这类突变体可能存在更复杂的致病机制。基因小鼠、多能干细胞技术以及基因编辑的方法可以为进一步的先天性肌强直机制研究提供方法[12，18-19]。

先天性肌强直无特效治疗方法，传统药物如美西律、卡马西平可能有效[20-29]。阻断钠离子通道功能，提高钾通道活性的钾通道激活剂瑞替加滨可以影响静息电位，缩短肌强直的时间[30]。有患者在服用雷诺嗪(500 mg，2次/d)后，僵硬、虚弱和疼痛明显好转，计时“起立-行走”测试、手僵硬、眼睑肌强直以及肌电图测试亦有改善[31]。

通过对这一家系的分析发现，在CLCN1基因存在一个新的基因突变位点c1879A>C突变，该突变在家系中与表型共分离，对美西律反应较好，可认为CLCN1基因c.1879A>C突变是导致该家系先天性肌强直的病因，证实了该突变基因在先天性肌强直发病中的作用，为在中国先天性肌强直家系中发现了新的CLCN1突变位点，为研究中国人群CLCN1突变类型、遗传方式及机制研究提供了一定的参考。