胶原-壳聚糖支架对脊髓损伤后运动功能恢复作用的实验研究

朱 旭 于国渊 杨华堂 张 宁 王喜旺 王 晶 王如科

邯郸市中心医院，河北 邯郸 056000

随着人类交通工具使用的不断增加，脊髓损伤(SCI)的发病率也与日俱增，SCI的高致残率给社会带来沉重的负担。脊髓局部不利于神经修复的主要原因是损伤后各种炎症因子的刺激，脊髓液化及空洞形成，胶质瘢痕增生及髓鞘抑制因子等共同作用导致。因此，SCI的治疗成为医疗界的一个巨大挑战[1-5]。最近研究表明，在给予足够的神经营养和适宜的生长环境下，破坏后的人类中枢神经系统可以缓慢的进行再生[6]。根据这项神经系统的特点，启发人们通过各种手段和方法来引导神经系统的再生，并且支持帮助神经轴突穿过损伤后的瘢痕组织，扭转抑制因子形成的微环境来治疗SCI。近年来，组织工程学支架的发展为脊髓的修复和再生提供了治疗思路[7-8]。

利用组织工程仿生支架的多孔性为中枢神经纤维的攀爬提供桥梁，为轴突的延长和生长提供足够的物理和化学支撑；利用其生物相容性填补脊髓空腔；利用其低免疫原性重塑损伤后局部脊髓的微环境，减少损伤部位的胶原沉积和纤维性瘢痕形成[9-10]。目前该治疗方法以成为SCI研究的热点。另外，脊髓损伤后局部的病理生理及化学因素的改变对中枢神经的再次生长发育也起到了至关重要的作用。改善病理生理过程并帮助神经纤维抵抗各种炎性因子抑制是优质的支架材料必须具备的化学及生物特性[11]。众所周知，脊髓横断切断了大脑对脊髓的控制，导致对应的肢体运动功能和皮肤的痛温触觉及本体感觉的丧失。由于中枢神经系统的自我恢复能力和再生能力非常差，损伤后复杂的病理过程进一步增加了修复的难度。因此，SCI的致残率和致死率极高，临床治疗难度大，预后差。为神经的再次生长和发育提供营养支持,诱导神经纤维连接并形成完整的神经传导通路是目前探索治疗SCI的主要研究方向[12]。本试验通过大鼠 BBB评分和电生理活动评价各组大鼠后肢运动功能的恢复、HE染色和NF免疫荧光染色观察支架修复脊髓损伤的效果。本研究运用胶原-壳聚糖支架移植到全横断脊髓损伤处，探讨这种支架对运动功能的影响，为临床治疗脊髓损伤提供依据。

1 材料与方法

1．1支架制备选择新鲜牛肌腱，取剔除外膜及周围脂肪后剩余的结缔组织，用搅拌机充分研磨粉碎，在置入高速离心机离心之前先用0.05 mol/L Tris缓冲液浸泡10 h，离心后可得到乳白色的混悬液，静置后收集沉淀。配置含有消化蛋白酶的醋酸溶液，持续搅拌至蛋白酶完全溶解。将醋酸溶液加入到收集的乳白色沉淀中，待沉淀充分溶后解取上清液。利用盐析法收集盐析出的沉淀物并在4 ℃去离子水中充分清洗溶解，获得胶原蛋白凝胶。另外，将研磨后的壳聚糖粉末倒入醋酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解，按壳聚糖∶胶原质量比1∶3的比例将溶有壳聚糖的醋酸溶液与胶原蛋白凝胶混合，充分搅拌后高速离心。去除上清液后在4 ℃去离子水中充分清洗获得预胶化的混合材料,密封备用。将胶冻状的支架材料取出后置于实验型真空冷冻干燥机中24 h得到固定形态的多孔隙的脊髓仿生支架。用1%的NaOH 溶液浸泡支架12 h，反复冲洗，裁剪为3 mm×3 mm×3 mm的圆柱体，60Co灭菌后备用[13-14]。

1．2大鼠脊髓全横断模型的建立本实验的大鼠由军事医学科学院动物饲养中心提供。将 30 只雌性 SD大鼠适应性喂养1周，2 d更换草料，充分喂食，术前禁食不禁水8 h。采用腹腔注射麻醉，麻醉剂选择5%水合氯醛(7 mL/kg)。待大鼠完全麻醉后俯卧固定。在背部皮毛上均匀喷洒适量酒精喷雾剂清洁背部，待毛发干燥后用电剃刀剃除背部毛发,暴露皮肤,碘伏常规消毒。触摸脊柱,确定 T8-10棘突的位置,沿脊柱正中切开皮肤,切口约4 cm，钝性分离脊柱两侧肌肉组织。用金属推开器推开双侧的肌肉组织,充分暴露 T8-10棘突。止血钳提拉锥体，暴露脊柱间隙，利用咬骨钳咬开缺口并扩大，直至完全咬除对应的脊柱骨板，注意尽量沿正中方向咬除骨质暴露脊髓，避免损伤双侧静脉窦引起大出血，增加手术病死率。小鼠专用手术显微镜下用剪刀片沿正中划开脊髓的硬脊膜。将单根血管缝合线从脊髓底部穿过脊髓并提拉。眼科剪横断脊髓,大鼠双侧后肢抽搐数次后肌肉松弛无力，针刺无反应提示造模成功[15]。血凝酶减少出血，促进血液凝固，待术野完全干净后植入胶原-壳聚糖支架。术后大鼠分开低密度喂养，每日伤口碘伏消毒，腹腔注射青霉素预防感染，挤压膀胱辅助排尿，投放干果饼干等加强营养。加强手术切口护理，如出现伤口裂开及时处理，防止发生啃食现象。将实验动物随机分为3组，每组10只，分别为：(1)正常对照组(SHAM 组)；(2)单纯损伤组(SCI组)；(3)胶原-壳聚糖支架组(SCI+S组)。

1．3BBB运动功能评分 SCI术后每周在固定时间用BBB评分量表评估各组大鼠的双后肢运动功能[16]。

1．4电生理检测分别于术后即刻、术后1个月和术后2个月分别检测各组大鼠(n=5)双后肢运动电生理(motor evoked potentials MEP)活动。5%水合氯醛(7 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后固定在手术台。去除毛发并消毒后沿正中矢状切开头部皮肤及双下肢测量电极放置区域的皮肤。参比电极沿肌肉走行插入。诱发电位仪通过刺激大鼠肌肉记录运动诱发电位(MEP)的潜伏期、波幅及波形。将刺激电极置于冠状缝和矢状缝交叉处的皮质运动区，记录电极放置于胫后神经,刺激后在电位仪上记录MEP潜伏期、波幅及波形。每组5只大鼠,取平均值。

1．5HE染色造模后8周，将大鼠灌流后取出脊髓组织固定在4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋切片，后做HE(hematoxylineosin staining)染色。显微镜下观察脊髓断端瘢痕形成与修复及周围组织形态学的改变。经过Photoshop和IPP软件分析脊髓横断处再生的组织面积，得出脊髓损伤处的损伤修复程度百分比。

1．6NF免疫荧光染色造模后8周，将所有实验大鼠T7～T12脊髓行神经丝蛋白-200(NF-200)的免疫荧光染色，确定神经纤维的再生情况。将固定处理好的脊髓标本组织进行冰冻切片。含Triton-X 100的PBS常温透化处理20 min，PBS缓冲液洗3次，5 min/次。5% 的BSA，室温孵育20 min。滴加NF一抗，4 ℃过夜，PBS缓冲液洗3次，5 min/次。滴加相应二抗，37 ℃避光孵育50 min，PBS缓冲液洗洗3次，5 min/次。封片剂封片，在荧光显微镜下观察。经过Photoshop和IPP软件分析经脊髓损伤处的荧光相对密度，从而计算脊髓损伤处NF的百分比。

2 结果

2．1支架的外观真空冷冻干燥机冷冻干燥后得到S支架(图1A)。冷冻干燥后S支架质地柔韧，尺寸与大鼠脊髓接近(图1B)。

2．2成功建立大鼠全横断损伤模型图1C～F为造模的步骤。挂线法将缝合线穿过暴露的脊髓底部，提拉起脊髓后用手术剪刀离断，确保彻底离断脊髓组织。离断瞬间大鼠双下肢剧烈抽搐数次后各个关节松弛，无牵拉反射，提示造模成功。

图1 A：直接冷冻干燥的胶原-壳聚糖支架；B：裁剪后的胶原-壳聚糖支架；C：暴露脊髓节段；D：挂线法；E：全横断脊髓后形成的空腔；F：植入支架Figure 1 A：Direct freeze drying ofcollagen-chitosan scaffold；B：Cut into certain shape；C：Exposure of spinal cord segments；D：Hanging line method；E：The cavity formed after complete transection of the spinal cord；F：Scaffold implantation

2．3双后肢运动功能的恢复术后1周，各组大鼠后肢功能无明显恢复，BBB 评分组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后2周开始SCI+S组BBB评分均明显高于SCI组，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

电生理是临床上被广泛认可的评价神经功能强弱的方法，根据神经传导的方向及功能分为测量运动功能的诱发电位；测量感觉功能的体感诱发电位。电位的潜伏期和振幅分别代表神经纤维传导的速度和兴奋性。该实验对脊髓损伤术后即刻、术后1个月和术后2个月后对各组大鼠进行电生理检测。从MEP的波形图和统计图可以看出，在术后即刻SCI组和SCI+S的波形几乎检测不到(图3A～C)。在术后1个月和术后2个月，SCI组的潜伏期比SCI组的潜伏期明显更低(P<0.05)(图3A～B)，SCI+S组的振幅比SCI组明显更高(P<0.05)(图3A和图3C)。

图2 SHAM组、SCI组和SCI+S组大鼠造模后1～8周的BBB评分值比较Figure 2 The comparison of the BBB scores of sham group，SCI group and SCI + s group during 1-8 weeks after modeling

图3 造模后即刻、术后1个月和术后2个月电生理检测 A：3组MEP波形图；B：3组MEP潜伏期；C：3组MEP的振幅Figure 3 Electrophysiological examination immediately，1 month and 2 months after operation．A：Waveforms of MEP in three groups；B：Latency of MEP in three groups；C：Amplitude of MEP in three groups

2．4HE染色HE染色显示脊髓仿生支架植入体内2个月后对脊髓损伤的修复作用。图4展示为HE染色。SCI组 HE染色大体图，脊髓断端有明显的瘢痕增生，脊髓神经元大量死亡丢失形成空洞 (图4B 和图4E)。SCI+S组织结构紧凑致密，修复作用明显优于SCI组，瘢痕和空洞较少，SCI+S结构完整性明显优于SCI组(图4B、图4E、图4C和图4F)。相比单纯损伤组，植入S支架组明显增加脊髓损伤处的损伤修复程度百分比，有显著性差异(P<0.05)(图4F)。

图4 造模后2个月的3组HE染色 A、D：SHAM组的HE染色大体图；B、E：SCI组HE染色的大体图；C、F：SCI+S组HE染色的大体图；G：3组脊髓损伤处损伤修复程度百分比Figure 4 HE staining performed in three groups two months after modeling．A and D：HE stained for the sham group；B and E：HE stained for the SCI group；C and F：HE stained for the SCI+S group；G：The percentage of repair degree of spinal cord injury in three groups

2．5NF免疫荧光染色图5为脊髓全横断后2个月的NF免疫荧光染色。SHAM组可见大量的具有连续性的NF阳性纤维(红色)(图5A)。SCI组未见明显具有连续性的神经纤维(图5B)。SCI+S组比SCI组可见较多具有连续性的神经纤维(图5C)。SCI+S组脊髓损伤处NF百分比明显比SCI组的更高，差异有统计学意义(P<0.05)(图5D)。

图5 造模后2个月的NF免疫荧光染色 A：SHAM组NF荧光；B：SCI组NF荧光；C：SCI+S组NF荧光；D：3组脊髓损伤处的NF百分比Figure 5 NF immunofluorescence staining 2 months after modeling．A：NF immunofluorescence staining of the SHAM group；B：NF immunofluorescence staining of the SCI group；C：NF immunofluorescence staining of the SCI+S group；D：Percentage of NF at spinal cord injury in three groups

3 讨论

脊髓损伤后导致临床治疗效果不佳的主要原因是局部胶质瘢痕的形成，神经传导束的离断和大量神经细胞凋亡[17-18]。因此，如何克服局部瘢痕障碍同时促进神经元轴突再生、重建神经通路是脊髓损伤治疗的关键方面。组织工程的发展为脊髓治疗提供了新的治疗思路，通过合成材料的介入克服神经修复的难题，并在试验探索中取得良好的效果[19-20]。本实验采用真空冷冻干燥的脊髓支架治疗SCI。这种支架结构可以诱导断裂的神经纤维再次连接并形成完整的神经传导功能，为损伤的脊髓组织提供优良的神经生长环境[21]。

天然材料比人工合成材料具有更多的应用优势，如良好的生物相容性、适宜的生物降解性、形态重塑性强、人体免疫反应低。因此，天然材料被广泛应用于组织工程，生物医学等领域。但是，天然材料最明显的缺点是力学性能差，无法为组织提供足够的力学支撑。天然材料中，目前人类发现的最理想的用于生物组织的天然材料便是胶原。已有研究证实，将胶原蛋白作为支架植入损伤的脊髓内可以延长神经细胞存活时间并促进轴突生长[22]。组织工程学支架是否适合作为植入物植入到生物体内，其本质是考验该种支架的理化性质，其中最重要的能够促进脊髓顺利修复的性质是适宜的吸水率、孔隙率和降解率[23-25]。同时还需要有模拟脊髓硬度和弹性的力学性能[26]。胶原材料的多孔性为中枢神经纤维的攀爬提供桥梁，为轴突的延长和生长提供足够的物理和化学支撑；生物相容性填补脊髓空腔；低免疫原性重塑损伤后局部脊髓的微环境，减少损伤部位的胶原沉积和纤维性瘢痕形成[27]。然而降解速度快、力学性能差导致胶原无法单独使用，因此需要结合其他材料来弥补胶原材料的缺陷[28-29]。壳聚糖具有良好的延展性，有利于中枢神经细胞和轴突的依附，有利于刺激神经细胞的合成分泌生长因子及营养因子等优点[30]。聚糖是一种长而不分支的黏多糖为主体，在糖的某些部位上共价结合若干肽链而生成的复合物。可在一系列细胞外酶或溶酶体中细胞内酶的催化下进行降解，是药物携带的最佳载体。利用壳聚糖的高力学性能弥补天然材料的缺陷，将壳聚糖与胶原蛋白交联提高胶原支架机械强度[31]。大鼠后肢肌肉收缩强度和运动功能的恢复是组织工程应用临床治疗SCI的最终目标。本实验应用多种手段检测不同时间段组织工程仿生学支架对损伤后大鼠后肢功能恢复的作用。活体中采用运动功能评分(BBB评分)和电生理评价双后肢感觉运动及协调功能的恢复。离体后主要通过脊髓 HE 染色评价组织工程学支架对损伤后促进神经再次生长和发育并完成神经传导及功能恢复等方面作用;本实验不仅从大体层面证明支架对脊髓修复具有积极的作用，更进一步通过微观角度进一步证明组织工程学支架的有效性，增加了本实验的说服力。结果显示SCI+S组的治疗效果明显优于SCI组，表现在运动功能评分(BBB 评分)和电生理评价明显优于SCI组。与运动功能恢复相一致的是，从 HE染色和 NF 免疫荧光染色的结果可以得出，相比SCI组，支架治疗组从微观层面解释了改善了脊髓损伤后的病理过程，减轻水肿，减少瘢痕形成的原因，并证明了该支架可以明显促进神经再次生长和发育并完成神经传导，具有良好的临床应用前景。

胶原-壳聚糖支架减轻组织空洞和胶质瘢痕的形成，促进脊髓神经纤维再生和运动功能的恢复。