PGC-1α基因缺失对β-淀粉样蛋白诱导小鼠神经毒性的影响

孙治坤 马兴荣 陈 帅 贺 爽 张杰文△

1)河南省人民医院，河南 郑州 450003 2)郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种逐渐进展的退行性疾病，随着患者年龄的增加其症状也会逐渐恶化，并最终影响患者的日常生活行为能力[1]，其发病率是所有老年性痴呆类型中最高的一种。2019阿尔茨海默病协会报告指出，目前美国的AD患者约580万，预计到2050年，美国的AD患者将达到1 380万[2]。由于AD的潜伏期较长，研究认为在AD患者出现症状前20 a或更长的时间就开始出现脑部的一些病理变化，如出现大脑中参与思考、学习和记忆(认知功能)的部分神经元被破坏[3-4]，长期的这些大脑病理变化逐渐导致患者出现临床症状，如记忆力减退及言语障碍等，因此研究AD的发病机制，特别是早期的病理变化具有重要意义。但目前AD的发病机制还不完全清楚，主要与β-淀粉样蛋白的沉积和降解障碍有关[5-6]，研究认为Aβ的沉积和降解障碍导致Aβ的聚集，可诱发tau蛋白的超磷酸化、神经元丢失及突触传递功能障碍等一系列病理变化，最终导致临床上出现认知功能障碍。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)是调节线粒体生物合成及功能的核心因子[7-8]，具有调节能量代谢、氧化应激和线粒体的生物合成等功能。PGC-1α在哺乳动物体内的表达具有一定的组织特异性，主要存在于线粒体含量丰富的组织且对高能量需求较多的组织，如脂肪组织、骨骼肌、心脏、肝、脑及肾等组织。在鼠类脑组织中PGC-1α主要表达在皮质、纹状体、黑质、丘脑、海马和小脑的神经元[9]，尤其在GABA能神经元中表达较多，但在胶质细胞中几乎不存在[9-10]。由于PGC-1α在脑内广泛分布再加上它的生理功能，因此其与和氧化应激及线粒体功能障碍有关的一些神经系统疾病，如AD[11]、帕金森病[12]、亨廷顿病[13]等的发生发展具有密切的相关性。既往研究[14-17]也证实了这一点，然而目前国内外对PGC-1α在AD发病机制中作用的研究还处于起步与探索阶段。既往研究表明PGC-1α基因与AD的发病有明显相关性[16]，然而目前的研究尚不确定在整体实验中PGC-1α的降低或缺失对Aβ的神经毒性作用有无影响，因此本研究采用PGC-1α基因缺失小鼠观察Aβ对小鼠学习记忆功能、脑内胆碱能系统及氧化应激等的影响，旨在为AD发病机制的研究提供新的理论基础。

1 材料与方法

1．1实验对象及分组研究对象为健康的雄性PGC-1α基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠各12只，均来自美国杰克逊实验室，体质量20～22 g，月龄8～12周，常规饲养3 d后按照随机原则将每种基因型组小鼠分为对照组和Aβ注射组，每组6只。

1．2Aβ的处理Aβ1-40购买(Sigma公司)后加入生理盐水制成浓度为10 μg/μL的凝聚状态，在-80 ℃的冰箱里保存待用，使用前1 d从冰箱里取出然后在37 ℃温箱里孵育约24 h后使用。

1．3手术操作两种基因的Aβ注射组小鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内注射进行麻醉，小鼠颅骨用脑立体定位仪进行固定，经过备皮和消毒后，在头颅的顶中线切开一约1 cm的切口，仔细分开皮下组织，暴露出前囟中心点，然后以该点作为一个新的基准，在其后0.5 mm、中线旁1.0 mm处垂直进针，使用牙科钻钻开颅骨，5 μL微量进样器向小鼠颅内双侧侧脑室慢慢注入1 μL凝聚态的Aβ1-40，留针约5 min后缓慢撤针，然后进行皮肤的缝合和伤口的消毒等处理。两种基因组的对照组小鼠在双侧侧脑室里的注射物用等体积的生理盐水代替凝聚态的Aβ1-40，其他手术步骤及手术条件均相同。手术完成4周后进行各指标的测定。

1．4行为学评估依照以前的实验方法[18-19]，Morris水迷宫设备来自中国医科院，由3个部分组成：圆形的水池、摄像系统和分析系统。评估分为两个部分：(1)定位航行测试：对小鼠进行为期4 d的训练和测试。圆形水池的直径120 cm，壁为黑色，水中添加黑色食用色素使水变为黑色，水深30 cm，温度维持在22 ℃左右，将水池平均划分为4个象限，在第二个象限中放入一直径约9 cm的黑色圆形小平台，距离水面下1～2 cm。各组研究对象每天接受4次训练，每次180 s，每两次训练的间隔时间30 min，按随机原则选择每次训练的入水点，如果动物相邻2 d具有相同的入水顺序，则重新进行随机化选择。如果在训练时间内小鼠能爬上平台，则让它在台上停留30 s；如果小鼠不能发现平台，可把它指引到平台上并停留30 s。用摄像头追踪小鼠的游泳轨迹，并输入计算机中计算小鼠到达平台前的时间(潜伏期)和游泳距离。(2)空间搜索测试：在测试的第5天把小平台撤掉，然后随机分两次将小鼠放入水中，放入点为离原平台位置较远的两个象限，然后记录并分析小鼠在原第二象限内停留的时间和游泳距离占总游泳时间或总游泳距离的百分比。

1．5小鼠皮质和海马组织内胆碱乙酰转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)活性的检测依照之前的方法[18-19]，准备好冰盘和预冷的PBS液，小鼠经断头处死后，即刻剥离出脑组织，用预冷的PBS液冲刷干净后放入冰盘，快速仔细地分离出双侧的大脑皮质和海马组织，在冰浴中分别加入等量的冰生理盐水进行匀浆，然后在4 ℃的离心机中以5 000 r/min的速度离心10 min后取上清液为待测样品。检测各指标之前首先用BCA(购自Pierce公司，美国)法测定蛋白含量，然后按照试剂盒说明书检测各项指标(ChAT及AchE试剂盒来自中国南京建成生物工程研究所；GSH试剂盒来自美国Cayman Chemical公司；MDA和SOD试剂盒购自中国赛默飞世尔科技有限公司)。

2 结果

2．1Aβ对不同基因组小鼠学习记忆能力的影响

2．1．1 定位航行测试：训练前3 d各组测试对象平均上台前的潜伏期(第1天：F=0.813，P=0.457；第2天：F=1.369，P=0.277；第3天：F=1.436，P=0.261；图1A)以及上台前的游泳距离(第1天：F=0.297，P=0.83；第2天：F=0.565，P=0.645；第3天：F=0.725，P=0.549；图1B)均无明显差异。随着训练时间的增加，各组测试对象找到平台前所用时间及游泳距离均不断缩短。但第4天时各组测试对象平均上台前的潜伏期(F=16.464，P=0.000)及上台前的游泳距离(F=47.121，P=0.000)均出现明显差异，与同种基因小鼠的对照组相比，两种基因Aβ注射组小鼠的平均上台前所用时间(正常基因Aβ组：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ组：P=0.000；图1A)和游泳的距离(正常基因Aβ组：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ组：P=0.000；图1B)均明显增高，且PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ组的平均上台前所用时间(P=0.004，图1A)和游泳的距离(P=0.003，图1B)均明显高于正常基因小鼠注射Aβ组。

2．1．2 空间搜索试验：平台被撤除后各组测试对象在平台所在象限中游泳的时间百分比(F=62.078，P=0.000)和距离百分比(F=56.907，P=0.000)均出现明显差异。与同种基因小鼠的对照组相比，两种基因Aβ注射组动物在平台所在象限中游泳的时间百分比(正常基因Aβ组：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ组：P=0.000；图2A)和距离百分比(正常基因Aβ组：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ组：P=0.000；图2B)均明显降低，而PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ组在平台所在象限中游泳的时间百分比(P=0.000，图2A)和距离百分比(P=0.000，图2B)明显低于正常基因小鼠注射Aβ组。

图1 Aβ对不同基因组小鼠的学习记忆功能的作用 A：平均上台前各组小鼠的时间(潜伏期)；B：平均上台前各组小鼠游泳的距离(与同种基因对照组比较，*P<0.05；与正常基因Aβ组比较，#P<0.05)Figure 1 Effect of beta-amyloid on memory impairment in mice.The Morris water maze was used to evaluate the spatial learning and memory ability by measuring escape latency (A) and escape distances (B).*P<0.05 vs the same genome control group，#P<0.05 vs Aβ treatment normal genome group

图2 Aβ对不同基因组小鼠的学习记忆功能的作用 A：平台被撤除后各组小鼠在原来平台所在象限中游泳的时间百分比；B：平台被撤除后各组小鼠在原来平台所在象限中游泳的距离百分比(与同种基因对照组比较，*P<0.05；与正常基因Aβ组比较，#P<0.05)Figure 2 Effect of beta-amyloid on memory impairment in mice.A probe test was used to analyze maintenance of memory in the Morris water maze by measuring the percentage of time spent (A) and swimming distance percentage (B) in the target quadrant．*P<0.05 vs the same genome control group，#P<0.05 vs Aβ treatment normal genome group

2．2Aβ对不同基因组小鼠皮质和海马组织内ChAT和AchE活性的影响各组小鼠皮质和海马组织内ChAT和AchE活性的变化均出现明显差异(表1)。与同种基因组的对照组相比，两种不同基因小鼠注射Aβ组动物脑皮质和海马组织内的ChAT活性均明显降低(脑皮质：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000；海马：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000)，而AchE的活性却明显升高(脑皮质：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000；海马：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000)；与正常基因小鼠注射Aβ组相比，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ组脑皮质及海马组织内ChAT活性明显降低(脑皮质：P=0.001；海马：P=0.02)，而AchE的活性明显升高(脑皮质：P=0.000；海马：P=0.011)。见表1。

表1 Aβ对不同基因组小鼠皮质、海马ChAT和AchE活性的作用Table 1 Effect of beta-amyloid on the ChAT and AchE activity in cortex and

2．3Aβ对不同基因组小鼠大脑皮质和海马内氧化应激相关因子(SOD、GSH及MDA)活性的影响各组小鼠大脑皮质和海马组织内氧化应激相关因子的变化均出现明显差异(表2)。与同种基因组的对照组相比，两种不同基因Aβ注射组动物大脑皮质和海马组织内的SOD(脑皮质：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000；海马：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000)及GSH(脑皮质：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000；海马：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000)的活性均明显降低(P<0.05)，而MDA的活性却明显升高(脑皮质：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000；海马：正常基因Aβ组P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ组P=0.000)；与正常基因小鼠注射Aβ组动物相比，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ组动物的大脑皮质和海马组织内SOD(脑皮质：P=0.027；海马：P=0.001)及GSH(脑皮质：P=0.000；海马：P=0.014)的活性均明显降低，而MDA的活性则明显升高(脑皮质：P=0.000；海马：P=0.000)。见表2。

表2 Aβ对不同基因组小鼠皮质和海马组织内SOD、GSH及MDA活性的作用Table 2 Effect of beta-amyloid on the SOD，GSH and MDA activity in cortex and

3 讨论

PGC-1α是一种辅助激活核受体PPARγ的激活因子，该名字由其功能而来，在调节线粒体的功能和生物合成过程中具有重要作用[20-21]。既往研究表明其与多种神经系统疾病的发生发展具有密切的相关性，如在帕金森病的研究中，ZHENG等[22]用全基因组的Meta分析发现帕金森病患者中PGC-1α及其调控的下游基因表达下降。WANG等[23]研究认为PGC-1α的过表达可保护MPTP诱导的C57BL小鼠帕金森病模型的行为障碍及黑质中线粒体功能障碍[23]。SUN等[24]研究发现PGC-1α基因敲除小鼠可出现运动功能障碍及多巴胺神经元的丢失。对亨廷顿病的研究也发现，在亨廷顿病患者及动物模型的纹状体中均发现PGC-1α表达的降低[25-26]，在亨廷顿病转基因动物模型中β-拉帕酮可通过调节PGC-1α的活性而改善小鼠的运动障碍及线粒体功能的损伤[27]。然而目前对PGC-1α在AD发病机制中作用的研究还处于起步与探索阶段。

QIN等[28]利用全基因组微阵列分析的研究证明了PGC-1α在AD患者脑中RNA的表达随着AD患者痴呆病情的进展而显著降低，同时发现PGC-1α的蛋白含量与老年斑的病理学及脑内Aβ的含量呈负相关。KATSOURI等[29]利用病毒载体将PGC-1α注入APP23转基因鼠AD模型的脑内发现，注射PGC-1α的小鼠可通过减少β分泌酶的表达而减少Aβ斑块的产生，保护了大脑中的神经元凋亡。然而DUMONT等[30]的研究则给出了不同结论，其研究发现PGC-1α的过度表达可通过诱导线粒体异常、神经细胞死亡和行为亢进加剧Tg19959转基因小鼠的APP基因突变及与人类AD相关的神经病理学和行为学缺陷。在细胞水平的研究上，ZHANG等[31]研究发现PGC-1α能通过调节NF-κB信号传导通路保护Aβ诱导的神经母细胞瘤细胞的凋亡和炎症反应，然而目前的研究尚不确定整体实验中PGC-1α的降低或缺失对Aβ的神经毒性作用有无促进作用，因此本研究首次采用PGC-1α基因敲除小鼠整体水平上来研究PGC-1α对Aβ神经毒性作用，旨在为研究AD的发病机制提供新的理论基础及新的思路。

本研究发现PGC-1α基因敲除小鼠与正常基因小鼠的侧脑室注射入Aβ1-40后，PGC-1α基因敲除小鼠的学习记忆功能较正常基因小鼠明显减退，结合中枢胆碱能系统相关指标的检测结果发现，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ后较正常基因小鼠注射Aβ后脑内ChAT的活性明显下降而AchE活性明显升高。既往研究发现氧化应激与阿尔茨海默病的发病密切相关[32-34]，在AD发病过程中氧化应激反应具有重要作用，Aβ的聚集会将会导致大量活性氧自由基的产生，活性氧自由基可诱发神经细胞膜上不饱和脂肪酸的过氧化反应，生成的过氧化脂质体(如丙二醛等)可以进一步破坏细胞膜蛋白的生理功能，最终导致神经细胞功能的丧失及代谢紊乱，引起患者临床上学习认知及记忆功能的明显下降[35-36]。大量产生的氧自由基又反过来干扰Aβ的降解，促进Aβ的聚集[37]。线粒体可以调节细胞内氧化-还原状态，它是体内活性氧自由基产生的主要部位[38]。研究表明PGC-1α在调节线粒体氧化应激的过程中可直接调节多种抗氧化因子的表达，如锰超氧化物歧化酶、过氧化物酶3和5、过氧化氢酶、硫氧还蛋白2、解偶联蛋白2和硫氧还蛋白还原酶等，从而防止氧化损伤和线粒体功能障碍[39-41]。本研究通过检测各组动物脑内氧化应激相关指标发现，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ组较正常基因小鼠注射Aβ组脑内SOD及GSH的活性明显降低，而MDA的活性则明显升高，提示PGC-1α基因的敲除可加重Aβ1-40诱发的氧化应激损伤。

本研究利用PGC-1α基因敲除小鼠从整体水平研究了PGC-1α基因的敲除可加重Aβ1-40诱导的小鼠的学习记忆障碍，其作用是通过胆碱能系统的调节失衡及加重氧化应激损伤实现的，本研究为深入探讨AD发病机制的研究提供了新的思路及理论基础。