河南省某肉牛屠宰场牛支原体感染情况调查

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002）

牛支原体（Mycoplasma bovis）是一种主要的、但通常被忽视的病原体，它属于柔膜体纲，是以缺乏细胞壁、最小的、能自我复制为特征的微生物。主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、生殖道炎症以及流产和不孕等疾病，对全世界的养牛业构成了主要威胁[1,2]。在中国，自2008年以来，该病原体已被证明对牛的健康构成威胁，大约10%的致死率主要是由牛支原体引起的肺炎，到目前为止，还没有有效的疫苗来阻止牛支原体的感染。与此同时，由于细菌耐药性的增强，抗生素治疗正在降低其有效性，使得它的控制变得难以实现和困难[3,4]。鉴于此，本研究从河南省肉牛屠宰场中采集病料进行了牛支原体分离鉴定，旨在对河南省牛支原体的流行病学进行调查，为牛支原体的诊断、疫苗的研制开发以及牛支原体病的综合防治奠定基础。

1 材料和方法

1．1 病料与毒株

于2019年12月，从河南省某肉牛屠宰场采集肺等病料共计320份。样品低温运送至实验室。牛支原体HB0801株，由华中农业大学郭爱珍教授惠赠。

1．2 主要试剂

PPLO肉汤粉、TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白大豆琼脂），购自BD有限公司；酵母粉、琼脂粉，购自美国BD公司；葡萄糖、酚红，购自上海国药集团公司；MEM、马血清，购自Hyclone公司；青霉素，购自华北制药集团公司；精氨酸，购自Roche公司；2×Direct PCR Mix、Hot Start Taq酶、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1．3 培养基的配制

PPLO液体培养基：PPLO肉汤粉10.5g、葡萄糖2.5g、酵母粉2.5g，溶于440mL超纯水中，115℃灭菌15min，加MEM 5mL、马血清50mL、8万单位青霉素5mL、10%精氨酸10mL和1% 酚红500μL。PPLO固体培养基：含1.5% 琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

1．4 引物的设计

根据GenBank中牛支原体16S rRNA基因设计1对通用引物，用于牛支原体的扩增。上游引物P1：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’，下游引物P2：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’， 预计扩增目的片段1 390bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1．5 牛支原体的分离培养

将无菌条件下采集的肺组织切成小块，加入2mL PBS，碾磨后将上清以5 000r/min离心3min，然后用0.45μm滤膜过滤，加入到有酚红的PPLO液体培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。3～5d后，转接至PPLO液体培养基传代，直至液体颜色由红色变为黄色，取100μL涂布PPLO固体培养基表面，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。3～5d后，肉眼观察生长情况并在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态。

1．6 牛支原体的鉴定

将疑似支原体菌落接种PPLO液体培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养3d。培养基由红色变为黄色时，收集菌体，用DNA提取试剂盒提取DNA，分别用P1、P2扩增并测序鉴定。以牛支原体HB0801株为阳性对照。

2 结果与分析

2．1 牛支原体的分离培养

肺组织培养3～5d、传代1～3代后，PPLO液体培养基逐渐变黄，PPLO平板上肉眼可见极小的针尖状菌落，低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，为多样并有典型的支原体“煎荷包蛋样”（图1）。吉姆萨染色，油镜下观察支原体菌体形态，为多形态，呈球菌样、弯曲的丝状、螺旋状（图2）。320份病料中形态上疑似为牛支原体的共计97株。

图1 牛支原体菌落显微镜下形态

图2 牛支原体菌体吉姆萨染色显微镜下形态

2．2 牛支原体的PCR鉴定结果

将97株疑似牛支原体菌体提取DNA扩增，经测序有15株与牛支原体 HB0801-P180株（GenBank No：CP007591）同源性在98%以上。证明所分离的15株毒株为牛支原体，其余经鉴定均为无胆甾原体或精氨酸支原体等。

图3 牛支原体PCR鉴定结果

结合以上结果，共从320份病料中分离鉴定出15株牛支原体，分离率达4.68%。

3 结论与讨论

本试验于2019年12月在河南省某肉牛屠宰场采集肺等样品共计320份，分离出疑似支原体97株，鉴定结果有15株为牛支原体。

由于牛支原体与其他支原体和无胆甾原体形态上非常相似，难以区分，故在进行支原体培养时，分离出97株形态类似的菌体，通过测序比对，发现大多为无胆甾原体、精氨酸支原体等。这些不致病的病原在形态上与牛支原体很难区分，只有通过测序才能将其鉴定出，最后从320份样品中分离鉴定出15株牛支原体。在屠宰场中看似健康的成年肉牛感染率也是较高的，有相当一部分肺脏样品表现不同程度的肉样实变。因此，分离的病原均为牛支原体，而不是丝状支原体或其他支原体。

2008年以来我国多数地区均报道有牛支原体的感染情况[5～12]，而河南省牛支原体的报道相对较少[13～15]，本研究对河南省肉牛屠宰场的支原体进行了分离鉴定，从结果看，河南省牛支原体在屠宰场的感染情况十分严重，阳性率高达4.68%。对屠宰场牛支原体的感染应当引起足够的重视。应加强屠宰场的管理和检疫，以防止本病的扩散和蔓延。