甘肃省武威市凉州区奶牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查与分析

王衡，满海燕

（1.甘肃省武威市凉州区永昌镇畜牧兽医服务站，武威 733000；2.甘肃省武威市凉州区农产品质量安全监督管理站，武威 733000）

牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的牛的一种以腹泻、胃肠炎、消化道黏膜糜烂及坏死为主要特征的接触性传染病[1,2]，BVDV进入机体后会破坏牛的自身免疫系统，使机体处于免疫耐受和持续感染状态，导致免疫力下降，使病牛容易被致病菌侵袭而感染其他疾病[3,4]。由于牛群中BVDV持续感染的长期存在，只有通过流行病学监测并逐步淘汰持续带毒感染牛才能达到有效控制[5]。BVDV于1946年在美国纽约州被首次报道，随后呈全球范围内流行，目前已有部分发达国家宣称其已彻底消灭净化了BVDV，我国于1980年在吉林省某奶牛场一头突发高烧，肠道严重出血、糜烂和溃疡的高产奶牛中首次分离到BVDV[6]。近年来，随着我国奶牛养殖业的飞速发展，国外引种以及各地区之间贸易交流的日益频繁，BVDV传播风险逐步升高，BVDV感染已在一定程度上直接影响我国奶牛养殖业的可持续发展。为了掌握甘肃省武威市凉州区奶牛群中BVDV的流行情况，有效保护甘肃省奶牛养殖产业的健康发展，本研究采用RT-PCR方法对2017-2019年采集于甘肃省武威市凉州区的690份奶牛粪便样品进行了BVDV的流行病学调查与分析。

1 材料与方法

1．1 检测样品来源

2017～2019年，采集于甘肃省武威市凉州区奶牛不同养殖场及散养户的奶牛新鲜粪便样品共计690份，其中临床中具有明显腹泻症状的腹泻奶牛粪便样品243份，临床中没有表现出腹泻症状的牛只粪便样品447份。

1．2 主要试剂

病毒基因组RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR扩增试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1．3 粪便样品的处理与病毒基因组RNA的提取

将采集的新鲜粪便样品溶解于5倍体积灭菌生理盐水中，充分破碎、混合均匀后，以12 000r/min离心10min，吸取上清液0.2mL，利用病毒基因组RNA提取试剂盒依次提取690份粪便样品的病毒基因组RNA。

1．4 引物设计与合成

参照参考文献[7]的方法，设计1对BVDV特异性检测引物，上游引物序列为：5’-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3’，下游引物序列为：5’-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3’，该引物预扩增244bp的BVDV 5’端非编码区基因保守序列。

1．5 RT-PCR扩增与检测

利用合成的BVDV特异性检测引物分别对提取的690份粪便样品病毒基因组RNA进行一步法RT-PCR扩增。RT-PCR扩增体系为：2×Buffer 10μL、BVDV上游和下游引物各0.5μL、酶0.5μL、RNA 3.0μL、水5.5μL；RT-PCR扩增程序为：50℃ 30min；95℃3min；95℃ 20s，56℃ 20s，72℃ 20s，共35个循环；72℃ 8min。RT-PCR扩增结束后，取5μ L扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1．6 检测结果的比较分析

将690份检测样品的RT-PCR扩增结果依次进行不同年份下腹泻患牛粪便样品和无腹泻症状粪便样品的比较分析，掌握甘肃省武威市凉州区2017～2019年腹泻奶牛和健康奶牛BVDV的感染情况。

2 结果与分析

2．1 RT-PCR扩增结果

采用RT-PCR方法对采集于甘肃省武威市凉州区的690份粪便样品进行了BVDV的病原学检测，共检测出BVDV阳性样品114份，BVDV阴性样品576份，部分样品的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

图1 部分样品RT-PCR扩增结果

2．2 不同年份下总体样品的检测结果

表1为不同年份下690份奶牛粪便样品的总体检测结果。从表1可以看出，2017-2019年BVDV总体阳性感染率为16.52%，其中2017年、2018年、2019年的阳性感染率分别为12.50%、16.25%、19.77%，甘肃省武威市凉州区奶牛群中BVDV的阳性感染率呈现出逐年升高的趋势。

表1 不同年份下总体样品的检测结果 单位：份,%

2．3 不同年份下腹泻奶牛样品的检测结果

表2为不同年份下243份腹泻奶牛粪便样品的检测结果。从表2可以看出，2017-2019年腹泻奶牛中BVDV总体阳性感染率为35.80%，其中2017年、2018年、2019年的阳性感染率分别为28.57%、34.48%、41.94%，腹泻奶牛中BVDV的阳性感染率呈现出逐年升高的趋势。

表2 不同年份下腹泻奶牛样品的检测结果 单位：份,%

2．4 不同年份下健康奶牛样品的检测结果

表3为不同年份下447份无腹泻症状奶牛粪便样品的检测结果。从表3可以看出，2017-2019年这些奶牛中BVDV总体阳性感染率为6.04%，其中2017年、2018年、2019年的阳性感染率分别为4.65%、5.88%、7.27%，无腹泻症状奶牛BVDV的阳性感染率呈现出逐年升高的趋势。

表3 不同年份下无腹泻症状奶牛样品的检测结果 单位：份,%

3 讨论

BVDV一直是引起奶牛相关腹泻性疾病的主要致病原之一，近年来随着我国奶牛养殖产业的不断扩大，BVDV在奶牛群中的流行也日渐扩大，给我国奶牛养殖业带来了巨大威胁，当前我国奶牛养殖业比较密集的地区均陆续报道了BVDV的感染。商云鹏等[8]采用RT-PCR方法对采集于东北地区19个规模化奶牛场的血清样品进行了BVDV的病原学检测，结果显示有52.6%（10/19）的奶牛场检测出BVDV核酸阳性，东北地区大部分奶牛场中存在BVDV感染，且存在BVDV持续性感染牛。张世勋等[9]采用RT-PCR方法对黑龙江省4个规模化奶牛场（A～D场）奶牛耳组织样品进行了BVDV抗原检测，结果A场、B场、C场、D场奶牛BVDV阳性率分别为0.5%（1/193）、0.2%（2/875）、1.8%（1/55）、0%（0/163），表明黑龙江省部分地区奶牛群中存在BVDV污染。张信军等[10]采用巢式RT-PCR方法对江苏省7个市和地区的13个大型规模化奶牛养殖场的100份血清样品进行BVDV抗原检测与基因分型，结果BVDV平均阳性感染率为55%（55/100），BVDV-Ⅰ型占11%（6/55），BVDV-Ⅱ型为78%（43/55），Ⅰ型与Ⅱ型混合感染占11%（6/55），表明BVDV在江苏省主要规模奶牛场普遍流行，且大部分牛场均能检测到BVDV持续感染牛。该BVDV感染的基因型包括基因Ⅰ型、Ⅱ型，但主要以Ⅱ型为主。本研究采用RT-PCR方法对2017～2019年采集于甘肃武威市凉州区的690份奶牛粪便样品（腹泻奶牛粪便样品243份，无腹泻症状奶牛粪便样品447份）进行了BVDV的病原学检测与分析，BVDV总体阳性感染率为16.52%（114/690），腹泻奶牛阳性感染率为35.80%（87/243），无腹泻症状奶牛阳性感染率为6.04%（27/447）。以上不同地区的流行病学调查资料共同表明，包括甘肃省武威市凉州区在内的我国奶牛养殖密集地区均存在BVDV的感染与流行，且不同地区的阳性感染率差异较大。同时，本次流行病学调查中发现甘肃省武威市凉州区奶牛群中BVDV的阳性感染率自2017-2019年有逐年升高的趋势，虽然升高的幅度并不是很大，但仍存在BVDV流行逐渐严重的势头，应引起足够重视，需要加强奶牛群中BVDV的综合防控工作。对于奶牛BVDV的综合防控，应采取以疫苗免疫接种为主，加强流行病学监测，根据流行病学监测结果逐步扑杀、淘汰阳性感染牛，早日实现奶牛群中BVDV的净化。