白皮杉醇抑制内质网应激保护四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤

刘文静高进贤 钱 倩蒲君峰石 磊吴树金*

(1.甘肃省人民医院药剂科,甘肃 兰州 730000;2.兰州大学基础医学院,甘肃 兰州 730000)

四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4) 诱导的化学性肝损伤模型被广泛用于急性肝损伤病理生理学机制研究[1],其主要分子学基础为CCl4经肝细胞色素P450 酶系代谢为毒性产物三氯甲基自由基() 和过氧化三氯甲基自由基(),这2种高毒性、高反应活性中间体可以损伤DNA 和生物膜,尤其是可以与内质网膜上的磷脂分子发生共价结合,引起脂质过氧化,从而启动内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS) 这一通路,进而诱导大量肝细胞过度凋亡,尤以中心静脉周围区域严重,成为CCl4诱导肝损伤的主要病理学改变[2-3]。内质网(endoplasmic reticulum,ER) 是一种存在于真核细胞中的细胞器,主要负责合成、折叠、修饰和转运蛋白,只有正确的折叠蛋白才能从ER 转运至高尔基体中,任何干扰氧化还原的调控都能够导致ERS；活性氧(reactive oxygen species,ROS) 水平过高会明显诱导内质网中蛋白的错误折叠,更为重要的是ERS 又会反过来通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR) 以及与线粒体之间的相互作用产生更多的ROS,两者之间形成负反馈,加速CCl4所致肝损伤,其中ROS成为触发内质网应激进而介导凋亡通路的关键上游信号分子,抗氧化应激则成为打破这一环路保护肝损伤的关键所在[4-5]。

目前,临床治疗肝损伤的大多数药物存在有效性差、不良反应多等问题,故研发疗效确切、安全性高的药物尤为重要。白皮杉醇主要存在于葡萄皮、红酒中,是多种传统中草药的有效成分,也为白藜芦醇的羟基化类似物[6],但它相比白藜芦醇具有更强的抗氧化活性,其原因除了含有4 个酚羟基,可以螯合氧自由基外[7],而且可主要通过一种新的蛋白激酶C 和酪氨酸激酶旁路来上调抗氧化酶血红素加氧酶(heme oxygenase-1,HO-1) 表达,该作用优于姜黄素、槲皮素、大多数均二苯乙烯化合物,从而保护细胞功能[8]。课题组前期发现,基于上调HO-1 抗氧化酶作用的药物可抑制肝细胞凋亡[9],故本实验在CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型中观察白皮杉醇的保护作用,同时探讨其机制是否与通过上调HO-1 抗氧化酶、抗氧化应激来抑制内质网应激途径介导的肝细胞凋亡有关。

1 材料

1.1 仪器 AU2700 型全自动生化分析仪、IX-70型荧光显微镜(日本Olympus 公司)；LS-50B 型荧光分光光度计(日本Shimadu 公司)。

1.2 试剂与药物 白皮杉醇(纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司),临用时用1.5%DMSO 初溶后,0.9%生理盐水配制成2 g/L 母液备用；水飞蓟素(纯度≥98%,成都曼斯特生物科技有限公司)。CCl4为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司),临用时用植物油配成1%溶液；DMSO (上海拜力生物科技有限公司)；SOD、GSH、MDA 检测试剂盒 (南京建成生物工程研究所)；PERK、ATF4、CHOP、TRB3、caspase-12、β-ACTIN 抗体(美国Santa Cruz Biotechnology 公司)；TUNEL 试剂盒(瑞士Roche 公司)；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 60 只SPF 级雄性昆明小鼠,体质量18～22 g,购于甘肃省中医药大学实验动物中心,动物生产许可证号SCXK (甘) 2015-0002。

2 方法与结果

2.1 动物肝损伤模型的制备 参考文献[10]报道,将60 只雄性昆明小鼠适应性饲养7 d,随机分为对照组,CCl4组,水飞蓟素阳性对照组,低、中、高剂量白皮杉醇保护组,每组10 只。水飞蓟素组给予腹腔注射(20 mg/kg),基于白皮杉醇对抗氧化酶HO-1 的作用为时间依赖性,根据以往文献报道及我们前期预实验的结果,白皮杉醇保护组分别腹腔注射给予10、20、40 mg/kg,每天1 次、共计7 d[11],对照组、模型组分别腹腔注射等体积生理盐水。末次给药1 h 后,对照组小鼠腹腔注射植物油(10 mL/kg),其余组小鼠腹腔注射给予5% CCl4(10 mL/kg) 油溶液。24 h 后小鼠眼眶采血、离心(2 000 r/min,15 min) 取血清-20 ℃冻存待测；解剖取肝脏组织,保存备用。

2.2 统计学分析 采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以表示,多组间比较采用方差分析,病理分级统计数据釆用Mann-Whitney U 检验。 P ＜0.05 或P＜0.01 为差异有统计学意义。

2.3 白皮杉醇对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清指标的影响 使用全自动生化分析仪检测AST、ALT、TP、Alb 和A/G 比。由表1 可知,与正常对照组相比,CCl4模型组小鼠血清ALT、AST 值显著升高(P ＜0.01),TP、Alb、A/G 比明显降低；不同剂量的白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 和水飞蓟素均可有效抑制急性肝损伤小鼠血清ALT、AST 值的增高和TP、Alb、A/G 比的降低 (P ＜0.05,P＜0.01)。

表1 白皮杉醇对CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠血清指标的影响（，n=10）Tab.1 Effects of piceatannol on levels of serum indexes of mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

注:与对照组比较,**P＜0.01；与模型组比较,+P＜0.05,++P＜0.01。

2.4 白皮杉醇对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学的影响 取小鼠肝右叶条形组织200 mg,福尔马林溶液固定24 h、石蜡包埋、切片(厚度为4 μm),常规HE 染色,中性树脂封片,光镜下观察肝组织结构的病理变化。由病理科专业医师分析鉴定。依据肝损伤程度评分标准[10]:0级,正常肝组织细胞；1 级,肝细胞轻微肿胀,散发炎性细胞浸润,个别肝细胞坏死；2 级,肝小叶不超过1/3 的局灶或斑块性肝细胞坏死,聚集性炎性细胞浸润；3 级,肝小叶1/3 至1/2 的广泛肝细胞坏死,大量炎性细胞浸润；4 级,肝小叶超过1/2的肝细胞坏死,广泛炎性细胞浸润。

由图1 可见,对照组小鼠肝细胞结构完整、排列整齐,细胞核大小正常,核质淡染。模型组小鼠大量肝细胞变性肿胀,汇管区可见大量炎性细胞浸润,肝索排列紊乱,肝细胞脂肪变性,胞浆疏松呈空泡状,散在凋亡小体。白皮杉醇 (10、20、40 mg/kg) 组和水飞蓟素组小鼠变性坏死肝细胞和浸润的炎症细胞均不同程度减轻,病理损伤级别降低(表2)。该结果提示白皮杉醇能显著降低小鼠急性肝损伤程度。

图1 白皮杉醇对CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠的肝脏病理组织学影响（×200）Fig.1 Histopathological analysis of mice with CCl4-induced acute liver injury subjected to piceatannol treatment （×200）

表2 白皮杉醇对CCl4 诱导的急性小鼠肝损伤病理组织学评分影响（n=10）Tab.2 Histopathological grades of mice with CCl4-induced liver injury subjected to piceatannol treatment （n=10）

2.5 白皮杉醇对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响 TUNEL 法检测肝细胞凋亡。按照试剂盒说明书操作,将肝组织石蜡切片采用二甲苯常规脱蜡,乙醇梯度水化,PBS (pH 7.4) 漂洗3次,每次5 min；加入蛋白酶K 工作液37 ℃反应30 min,PBS 漂洗3× 5 min,4% 多聚甲醛 (pH 7.4 的PBS) 室温固定30 min,PBS 漂洗3× 5 min,浸入封闭液(3% H2O2) 室温封闭10 min,PBS 漂洗3× 5 min；样品上加入适量TUNEL 检测液,37 ℃避光孵育60 min,PBS 漂洗3× 5 min,去除PBS 液,每张切片加50～100 μL DAPI 染液,室温避光孵育5 min。PBS 洗3 次,每次5 min。滴加适量的抗荧光淬灭剂于组织上,盖玻片封片,荧光显微镜下使用激发波长450 nm、发射波550 nm 观察。凋亡细胞由于DNA 断裂暴露出3’ -羧基末端而被标记为绿色,每张切片随机选取5 个视野计数凋亡细胞数,实验结果采用Image Pro plus 6.0 图像分析软件进行统计,结果以阳性细胞数/细胞总数×100%表示。

由图2 可见,与对照组比较,CCl4模型组小鼠肝细胞凋亡显著增加(P＜0.01),尤其以中心静脉周围处明显,白皮杉醇 (10、20、40 mg/kg)组和水飞蓟素组与CCl4模型组比较,细胞凋亡显著减少(P＜0.05,P＜0.01),且随白皮杉醇浓度的升高,细胞凋亡明显下降。

2.6 白皮杉醇对急性肝损伤小鼠肝组织内质网应激信号通路相关蛋白表达的影响[12]取肝组织,裂解液裂解,7 000 r/min 低温离心10 min,取上清液待测。取80 μg 蛋白,加入上样缓冲液煮沸变性,10% SDS-PAGE 电泳,将蛋白转印到PVDF 膜上,5%的脱脂奶粉室温封闭1 h。加入相应一抗4 ℃孵育过夜,再加二抗室温孵育1 h,ECL 显色,拍照。Gel-Pro analyzer 4.0 软件分析结果。

内质网应激通路是机体内细胞凋亡的三大重要途径之一,为了验证白皮杉醇是否通过抑制ERS保护CCl4所致肝细胞凋亡,本研究采用Western blot 法检测了ERS 诱导细胞凋亡途径中的关键相关凋亡因子的表达。结果如图3 所示,与对照组相比,CCl4模型组小鼠肝组织中PERK、ATF4、CHOP 蛋白表达水平显著增高(P＜0.01)；与模型组相比,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 与水飞蓟素均可显著抑制小鼠肝组织ERS 通路相关蛋白PERK (图3A)、ATF4 (图3B)、CHOP (图3C)的表达(P＜0.01),提示白皮杉醇可能通过内质网PERK-ATF4-CHOP 途径抑制CCl4所致肝细胞凋亡。

2.7 白皮杉醇对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织TRB3 蛋白表达的影响 CHOP 通路是ERS 诱导细胞凋亡的关键环节,为了进一步明确ERS 在白皮杉醇保护肝损伤中的作用,本研究直接检测了CHOP 的下游靶基因TRB3 的表达。结果如图4 所示,与对照组相比,CCl4模型组小鼠肝组织中TRB3 蛋白表达水平显著增高(P＜0.01)；与模型组相比,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 与水飞蓟素均可显著抑制TRB3 的表达(P＜0.01)。

2.8 白皮杉醇对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织caspase-12 蛋白表达的影响 鉴于caspase-12 诱导的细胞凋亡为ERS 特异性的,本研究使用Western blot,进一步检测了活化形式的cleaved Caspase-12蛋白表达,结果如图5 所示,与正常对照组相比,CCl4模型组小鼠肝组织中cleaved caspase-12 蛋白表达水平显著增高(P＜0.01)；与模型组相比,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 与水飞蓟素均可显著抑制cleaved caspase-12 的表达(P＜0.01)。

2.9 白皮杉醇对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH、MDA 的影响 取左前叶肝组织(约0.5 g),冷生理盐水冲洗,滤纸吸干,称定质量,剪碎,冰浴匀浆,制成10%组织匀浆,4 000 r/min低温离心15 min,取上清液待测。按照试剂盒说明书,采用硫代巴比妥酸比色法检测MDA 含有量,TNB 法检测GSH 水平,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。

图2 白皮杉醇对CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响（×200，，n=10）Fig.2 Hepatic cells apoptosis of mice with CCl4-induced acute liver injury subjected to piceatannol treatment （×200，，n=10）

为了探讨白皮杉醇对ERS 抑制的作用机制,本研究检测了氧化酶系的相关酶含有量表达。由表3 可知,与对照组比较,CCl4模型组小鼠肝组织SOD、GSH 水平明显降低(P＜0.01),MDA 水平明显增高(P ＜0.01)；与模型组比较,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 和水飞蓟素组可明显抑制急性肝损伤小鼠肝组织SOD 的降低和MDA 水平的升高(P＜0.01),10 mg/kg 白皮杉醇组与CCl4模型组相比GSH 水平差异无统计学意义(P ＞0.05),20、40 mg/kg 白皮杉醇组与CCl4模型组比较,GSH 水平显著升高,差异具有统计学意义(P ＜0.01)。

2.10 白皮杉醇对急性肝损伤小鼠肝组织HO-1 蛋白表达的影响 为了明确白皮杉醇抗氧化损伤的机制,本研究使用Western blot 检测了HO-1 蛋白的表达。结果如图6 所示,与对照组比较,CCl4模型组小鼠肝组织中HO-1 蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)；与模型组比较,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 与水飞蓟素均可显著抑制HO-1 的表达(P＜0.01)。

3 讨论

CCl4诱导的小鼠急性肝损伤首先体现在血清生化指标的变化,氧化应激时因肝细胞膜脂质化,进而通透性增加,导致大量AST、ALT 从肝脏转移入血,故AST、ALT 是反映肝损伤最早、最敏感的指标,其升高程度与肝损伤程度呈正相关[13]。本实验显示,不同剂量白皮杉醇可明显抑制CCl4诱导ALT、AST 水平的增高,以及TP、Alb、A/G 比的降低；白皮杉醇保护组肝细胞疏松化程度、炎症细胞浸润及脂肪变性情况均有不同程度的缓解,并呈一定的量效关系,并与血清学改变结果相一致,表明该成分可抑制CCl4诱导的肝细胞凋亡。

表3 白皮杉醇对CCl4 致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH、MDA 的影响（，n=10）Tab.3 Effects of piceatannol on hepatic SOD，GSH and MDA levels of mice with CCl4-induced liver injury（，n=10）

表3 白皮杉醇对CCl4 致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH、MDA 的影响（，n=10）Tab.3 Effects of piceatannol on hepatic SOD，GSH and MDA levels of mice with CCl4-induced liver injury（，n=10）

注:与对照组比较,**P＜0.01；与模型组比较,++P＜0.01。

机体内诱导细胞凋亡的途径主要为死亡受体、线粒体、ERS,而CCl4经肝细胞色素P450 酶系代谢的毒性产物具有强氧化性,极易与内质网膜磷脂结合,导致错误折叠蛋白在内质网腔内聚集,引起ERS,最终诱导肝细胞大量凋亡,故氧化应激与ERS 是CCl4所致肝损伤的中心事件。ERS 诱导细胞凋亡的重要信号分子为CHOP。CHOP 是ERS 特异的转录因子,属于C/EBP 转录因子家族成员,其编码的蛋白参与细胞凋亡过程,在非应激状态下,表达水平很低,而在ERS 时则大量表达[5,14]。本实验发现,CCl4可诱导肝细胞CHOP 大量表达,而不同剂量白皮杉醇可显著抑制CCl4诱导CHOP的表达,提示该成分对CCl4诱导细胞凋亡的抑制作用与ERS 相关。为了进一步探讨白皮杉醇对ERS 的作用机制,本实验检测了CHOP 上游调控因子PERK、ATF4 的表达,发现ERS 时PERK、ATF6、IRE-1 都能诱 导CHOP 转录,但PERKATF4 是CHOP 蛋白表达所必需的,而且是ERS 诱导CHOP 转录最重要的一条通路,PERK 信号通路的激活在ERS 早期因抑制蛋白质合成而发挥的是细胞保护作用,但随着ERS 时间延长,它通过诱导CHOP 的大量表达反而促进细胞凋亡[15-16]。有研究表明[17-18],TRB3 是新鉴定的CHOP 靶基因,ERS 可诱导TRB3 的表达,其表达要晚于CHOP,可能参与了CHOP 诱导的细胞凋亡,本实验显示,白皮杉醇可显著抑制CCl4诱导PERK-ATF4、TRB3的表达,初步验证了该成分可通过PERK-ATF4-CHOP-TRB3 抑制ERS 诱导的肝细胞的凋亡。

图4 白皮杉醇对CCl4 致急性肝损伤小鼠肝组织TRB3表达的影响（，n=10）Fig.4 Effect of piceatannol on expression of TRB3 in mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

图5 白皮杉醇对CCl4 致急性肝损伤小鼠肝组织cleaved caspase-12 蛋白表达的影响（，n=10）Fig.5 Effect of piceatannol on expression of cleaved caspase-12 in mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

图6 白皮杉醇对CCl4 致急性肝损伤小鼠肝组织HO-1 表达的影响（，n=10）Fig.6 Effect of piceatannol on expression of hepatic HO-1 of mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

同时,本实验直接检测了caspase-12 表达,其定位于ER 外膜,是ERS 介导的凋亡特有的关键分子,在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化,而ERS 可引起其激活,后者切割并激活caspase-9,进而激活caspase 级联途径诱导细胞凋亡[19]。结果,白皮杉醇可以显著抑制CCl4诱导caspase-12的表达,进一步验证了该成分保护CCl4诱导的急性肝损伤与其抑制ERS 有关。

在病理情况下,体内氧自由基产生过多或清除不足,过度激活的氧自由基可引起肝细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜发生脂质过氧化反应,产生脂质过氧化物及其降解产物(MDA),进一步加重细胞膜损伤,最终引起肝细胞的结构和功能障碍[20-21],血清SOD 活性和GSH 含有量是肝脏中最有效的抗氧化剂,可提高肝脏解毒能力、消除自由基、保护细胞膜结构和功能完整[22-23]。为了探讨白皮杉醇抑制ERS 的作用机制,本研究检测了肝组织相关抗氧化酶及脂质化合物的水平,发现该成分可明显升高GSH、SOD 水平,同时降低MDA 水平,减轻氧化应激反应。

SOD、GSH、MDA 水平主要间接反映了白皮杉醇对机体抗氧化能力的改变,为了进一步明确该成分的抗氧化作用机制,本实验直接检测了肝组织HO-1 的表达。结果显示,白皮杉醇可显著改善CCl4对HO-1 的下调作用,可能是通过一种新的蛋白激酶C 和酪氨酸激酶旁路来上调抗氧化酶血红素加氧酶(HO-1) 的表达,亦有相关报道通过激活NRF2 进而诱导HO-1 的表达[8],尚需进一步实验来证实。

综上所述,白皮杉醇对CCl4诱导急性肝损伤具有一定的保护作用,其机制可能与该成分上调HO-1、抑制ERS 介导的肝细胞凋亡有关。鉴于白皮杉醇相比其他均二苯乙烯化合物有着更优的药理作用,而且基于HO-1 靶点的相关药物被越来越多地应用于临床相关疾病的诊疗中,本实验可为该成分在化学性肝损伤中的应用提供了一定的依据,而且基于其对HO-1 的强效作用,也能为考察HO-1是否是化学性肝损伤的关键干预靶点提供依据。