玄黄益肾颗粒HPLC 指纹图谱建立及3 种成分同时测定

顾东华,曾海松,黄旭骅,李 伟

(扬子江药业集团江苏龙凤堂中药有限公司,江苏 泰州 225300)

玄黄益肾方是江苏省中医院临床经验方,用于治疗糖尿病肾病,疗效显著,由鬼箭羽、地黄、黄芪、知母、牡丹皮、玄参、菟丝子、炙水蛭、泽泻、大黄(制) 10 味药材组成,方中鬼箭羽性寒,味苦、辛,功效清热解毒、活血化瘀[1],可防治糖尿病肾病肾小球硬化[2-3]；水蛭性平,味咸、苦,功效活血化瘀,少量久服时化瘀而不伤正[4-6],二药相合为君,起到清热化瘀的作用。玄黄益肾颗粒是在对玄黄益肾方中药材进行提取、纯化的基础上制成的颗粒剂,功效益气养阴活血、补肾疏肝健脾,本实验建立了该制剂HPLC 指纹图谱,并同时测定了其中芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚的含有量[7-8],以期为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 XPE-205 型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司]；KQ-250B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；Milli-Q 型超纯水机(美国密理博公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脱(0～2 min,5%A；2～25 min,5%～16%A；25～36 min,16%～21.5%A；36～60 min,21.5%～52.5% A)；体积流 量1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长258 nm；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚对照品适量,置于量瓶中,60%甲醇定容至刻度,作为贮备液,精密吸取适量,加60%甲醇制成每1 mL 分别含三者15、10、40 μg 的溶液,即得。

2.3 供试品溶液制备 取颗粒适量,研钵研细后取约0.5 g,精密称定,置于100 mL 具塞锥形瓶中,精密加入60% 甲醇25 mL,超声 (100 W、40 kHz) 处理 20 min,放冷至室温,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.4 HPLC 指纹图谱建立

2.4.1 精密度试验 取颗粒(S1),按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,以2 号峰(芒果苷) 为参照,测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别小于0.37%、1.6%,表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取颗粒(S1),按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,分别于0、4、8、12、24、48 h在“2.1” 项下色谱条件进样测定,以2号峰(芒果苷) 为参照,测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别小于0.29%、2.3%,表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取颗粒(S1),按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,以2 号峰(芒果苷) 为参照,测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别小于0.54%、1.3%,表明该方法重复性良好。

2.4.4 耐用性试验 取颗粒(S1),按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,将“2.1” 项下色谱条件中的柱温、体积流量、流动相比例、波长进行微调后进样测定,同时更换仪器、色谱柱,以2 号峰(芒果苷) 为参照,测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于3%,表明该方法耐用性良好。

首先就体现在马戴诗中多次使用楚辞的意象，如白蘋、蕙兰、芳草、灵均、汀洲、湘水、女萝、云中君等，借以表达自己的一片赤诚之心。如其《谒仙观》其二云：“山空惠气香，乳管折云房。”[5]《楚江怀古三首》其一：“云中君不降，竟夕自悲秋。”[5]借鉴屈原以美人香草喻高洁的象征手法，表明自己能超越贬谪的痛苦，淡定地对待人生的变故和仕途的挫折。

2.4.5 相似度测定及图谱生成 取10 批颗粒,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,将色谱图转换为AIA 格式后导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723 版) ”,以S1 为参照,经多点校正和峰匹配后采用平均值法生成对照指纹图谱,相似度见表1,均大于0.97；指纹图谱见图1,可知共有10 个共有峰,其中2 号峰(芒果苷) 较高,出峰时间居中,与相邻色谱峰分离度良好,故选择其作为参照。

表1 10 批样品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for ten batches of samples

2.4.6 共有峰指认及归属 各药材HPLC 色谱图见图2,确定2、7、10 号共有峰分别为芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚,其归属见表2。

图2 各药材HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various medicinal materials

表2 共有峰归属Tab.2 Ownerships of common peaks

2.5 各成分含有量测定

2.5.1 系统适用性试验 取对照品、供试品溶液适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图3。由此可知,各成分理论塔板数按芒果苷计均大于6 000,色谱峰分离度均大于1.5,表明系统适用性符合相关要求。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 线性关系考察 精密量取“2.2”项下贮备液适量,60% 甲醇制成20%、50%、100%、200%、300%、400%、500% 水平的对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表3,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度试验 取“2.2” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚峰面积RSD 分别为0.15%、0.13%、0.053%,表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一批颗粒 (S1),按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,另取“2.2” 项下对照品溶 液,分别于0、4、8、12、18、24、36、48、60、72 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得2 种溶液中芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚峰面积RSD 分别为1.3%、1.5%、1.7% 和0.73%、0.76%、0.37%,表明供试品溶液在72 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取同一批颗粒 (S1),按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚含有量RSD 分别为0.43%、0.45%、0.38%,表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取同一批颗粒(S1)(芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚质量分数分别为0.747 7、0.490 9、2.081 mg/g) 9 份,平均分成3组,每份约0.25 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,分别按0.5∶1、1∶1、1.5∶1 水平精密加入对照品溶液(芒果苷0.093 6、0.187 2、0.280 8 mg,金丝桃苷0.062 4、0.124 8、0.187 2 mg,丹皮酚0.250 0、0.510 0、0.765 0 mg) 25 mL,超 声(100 W、40 kHz) 处理20 min,放冷至室温,摇匀,经0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚平均加样回收率分别为101.09%、99.90%,99.08%,RSD 分别为0.90%、0.54%、0.37%。

2.5.7 样品含有量测定 取10 批颗粒,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算含有量,结果见表4。初步确定,芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚质控范围分别不低于0.61、0.35、1.4 mg/g (含有量均值的70%作为质控下限)。

表4 各成分含有量测定结果（mg/g，n=2）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，n=2）

3 讨论

3.1 指标成分确定 玄黄益肾颗粒提取工艺有2条工艺路线,为了全面控制提取过程,对每条路线均设定指标成分,其中单提药材牡丹性微寒,味苦、辛,功效清热凉血、活血散瘀,其主要活性成分丹皮酚具有保肝护肾、降血糖、抗菌、消炎的作用[9-10],同时还能降低低密度脂蛋白表达,抑制脂质过氧化反应,改善血液流变性[11-12]；另1 条工艺路线中知母功效清热泻火、滋阴润燥,芒果苷是其指标成分之一,具有降糖作用[13-14],并且菟丝子功效补肾益精[15-16],金丝桃苷是其有效成分之一。因此,本实验选择芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚作为指标成分。

3.2 样品前处理方法确定 本实验先以甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水为提取溶剂,色谱峰数量、信号强度、基线平稳程度为指标,最终确定甲醇作为最佳提取溶剂。再考察了不同体积分数甲醇的提取效果,最终确定为60%。然后,研究了溶剂用量、提取时间等因素,发现50 倍量下超声处理20 min 即可充分提取。

3.3 色谱条件确定 本实验首先考察了甲醇-水、乙腈-水体系,发现后者基线平稳,色谱峰峰型良好,为了进一步改善色谱峰峰形及分离度,在水中加入不同体积分数磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸,发现0.1%磷酸效果较理想。再采用二极管阵列检测器进行全波长采集,发现在230 nm 处色谱峰数量最多,同时考虑到各成分色谱峰信号强度情况(芒果苷、金丝桃苷、丹皮酚最大吸收波长分别为258、360、274 nm),最终确定258 nm 作为检测波长。