葛根素通过miR- 490/E3泛素连接酶抑制非小细胞肺癌细胞生长、侵袭和迁移

张钰欣，张臻臻，赵利刚，赵琳琳

华北理工大学药学院，河北唐山 063000

肺癌是最常见的癌症之一，也是目前全球癌症死亡的主要原因之一[1- 2]。根据组织学类型分类，肺癌主要包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌患者约占83%，且大多数确诊患者均为晚期疾病，治疗难、易复发、生存期短[3- 4]。因此，探究治疗药物及其作用机制对延长患者生存期，改善预后至关重要。

葛根素(puerarin)是从葛根中提取的主要生物活性成分，属于异黄酮类化合物[5- 6]，具有舒张血管、保护心脏、保护神经、抗氧化、抗癌、抗炎、减轻疼痛、促进骨形成、抑制酒精摄入和减轻胰岛素抵抗等作用，因此被广泛应用于心脑血管疾病、糖尿病、帕金森病、骨坏死以及子宫内膜异位症等疾病的治疗[7- 10]。近期研究发现，葛根素具有抗癌作用，能够抑制胃癌、肝癌、乳腺癌等癌细胞生长，并诱导细胞凋亡[11- 12]。目前有关葛根素对肺癌细胞影响的研究甚少，且葛根素在肺癌细胞中的调控机制尚未明确。

有研究发现，葛根素可通过调控细胞内microRNA的表达，发挥抑癌作用[13- 14]。本课题组前期实验显示，不同浓度葛根素处理后miR- 490的表达明显升高。miR- 490是目前研究较多的抑癌因子之一，可抑制胃癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌等恶性肿瘤的生长、迁移和侵袭[15- 17]。miR- 490在非小细胞肺癌中同样具有抑癌作用[18]。且经过生物信息学筛选发现miR- 490潜在下游靶基因为E3泛素连接酶(denticleless E3 ubiquitin protein ligase，DTL)，DTL在非小细胞肺癌中表达异常上调[19]。本研究通过培养非小细胞肺癌细胞株A549细胞，并对细胞进行分组处理，研究了葛根素对非小细胞肺癌生长、侵袭和迁移的影响，探讨相关的分子调控机制。

材料和方法

细胞培养及分组A549细胞购自ATCC库，37 ℃、5% CO2条件下采用90% RPMI- 1640+10% FBS培养基，同时补充10%胎牛血清(Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA)和100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素进行培养。葛根素以100 mmol/L浓度的储备液储存于DMSO中，温度为-20 ℃，并用无血清培养基稀释，以供实验使用。细胞培养24 h后，采用0、5、10、20 μmol/L浓度的葛根素处理A549细胞，处理24 h，然后进行分组以供后续实验，包括如下6组：(1)对照组：单纯DMSO处理；(2)葛根素组：单纯葛根素处理；(3)葛根素+miR- 490阴性对照组：葛根素处理，转染miR- 490阴性对照；(4)葛根素+miR- 490沉默模拟物组：葛根素处理，转染miR- 490沉默模拟物；(5)葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组：葛根素处理，转染miR- 490沉默模拟物和DTL阴性对照；(6)葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL沉默质粒组：葛根素处理，转染miR- 490沉默质粒和DTL沉默质粒。此外，为确认质粒转染成功并采用双荧光素酶报告分析验证miR- 490靶向调控DTL表达，将未经葛根素处理的A549细胞分为以下4组：(1)miR- 490过表达对照组：转染miR- 490模拟物阴性对照；(2)miR- 490过表达模拟物组：转染miR- 490过表达模拟物；(3)miR- 490沉默阴性对照组：转染miR- 490沉默阴性对照；(4)miR- 490沉默组：转染miR- 490沉默质粒。miR- 490过表达模拟物和抑制物及其阴性对照购自上海吉玛基因公司。si-NC与Si-DTL均由美国Thermo fisher公司设计并合成。将A549细胞分别以1×106个/孔接种于6孔板中过夜，采用Lipofectamine 2000转染试剂转染细胞。

qRT-PCR检测根据操作说明书，采用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，TIANScript cDNA第一链合成试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]进行反转录，SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(日本Takara公司)进行qRT-PCR，其中，miR- 490使用U6进行标准化分析，DTL、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)使用GAPDH进行标准化分析。采用ABI 7500检测系统(美国Applied Biosystems公司)进行qRT-PCR检测，每个样本重复3次，用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

Western blot检测取处理后的细胞，移除细胞培养瓶中的细胞培养液，用预冷的PBS洗3遍，加入含有10%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液 (MCE，USA)，将细胞样品移至1.5 ml离心管中，13 000 ×g离心10 min取上清，BCA法测定蛋白质浓度后保存于-20 ℃备用。采用SDS-PAGE凝胶试剂盒配制12%分离胶和浓缩胶，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至NC膜上，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h。滴加稀释的一抗兔抗DTL (ab184548，abcam，USA)、E-cadherin (14- 3249- 82，Thermo Fisher，USA)、N-cadherin(PA5- 19486，Thermo Fisher，USA)、Vimentin (PA5- 27231，Thermo Fisher，USA)。4 ℃过夜，次日用PBST洗膜3次，每次10 min，孵育二抗IgG (a0208，上海碧云天生物技术有限公司)，室温置于摇床振荡2 h，再次用PBST洗膜3次，每次10 min。加入显影剂并通过Bio-Rad凝胶成像系统显影 (MG8600，北京托摩根生物科技有限公司)，使用IPP7.0软件 (Media Cybernetics，Singapore) 进行定量分析。

CCK- 8法检测采用CCK- 8试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)检测葛根素对A549细胞生长的抑制作用，具体为：A549细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板中，用5、10、20 μmol/L葛根素处理不同时间点的细胞，并设不加药物处理(0 μmol/L)的细胞作为对照组；向每个孔中加入1/10体积的CCK- 8溶液，37 ℃、5% CO2条件下将培养皿再培养2 h；使用微板阅读器(Bio-Rad Laboratories，USA)在450 nm波长下测定光密度。每个实验分3次进行，结果表示为抑制率(inhibition rate，IR)，计算公式如下：IR(%)=[(A-B)/A]× 100，其中A和B分别为对照组和样品组在不同孵育时间点后的吸光度。

Transwell检测采用包被基质凝胶(Becton Dickinson，USA)的Transwell膜对A549细胞进行体外侵袭性检测，无包被基质凝胶的Transwell膜进行细胞迁移能力检测。用加葛根素(20 μmol/L)预处理24 h的A549细胞在无血清培养基中以2×104个/孔的速度被镀在上腔中，在下腔的培养基中加入20%的胎牛血清。孵育24 h后，用棉签从上孔中取出非侵袭性细胞，底部细胞用95%乙醇固定，苏木精染色。随机选取10个视野进行细胞计数，实验重复3次。

双荧光素酶报告检测使用TargetScan数据库(http：//www.targetscan.org/vert_72/)进行miR- 490和DTL结合位点分析，并获取含有作用位点的片段序列。分别克隆扩增miR- 490全长、DTL的3’UTR区到pmirGLO (E1330，Promega，USA) 荧光素酶报告载体上，命名为DTL-Wt。预测miR- 490和DTL的结合位点，进行定点突变，构建DTL-Mut载体，内参为表达海肾荧光素酶的pRL-TK载体 (E2241，Promega，USA)，miR- 490过表达质粒及过表达阴性质粒分别与荧光素酶报告载体共转染进入293T细胞，荧光检测仪 (Glomax20/20，Promega，USA) 检测荧光强度。

统计学处理采用SPSS 23.0统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用Studentt检验或方差分析，并进行Bonferroni校正[20]，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

葛根素抑制非小细胞肺癌细胞生长，上调miR- 490表达，下调DTL表达用不同浓度的葛根素处理A549细胞，CCK- 8法检测经葛根素处理后细胞生长抑制率，结果显示，随着浓度逐步升高，细胞抑制率逐步升高(F=105.375，P<0.001)(图1A)。qRT-PCR检测细胞中miR- 490和DTL的表达，结果显示，随着葛根素浓度升高，miR- 490表达逐步升高(F=32.919，P<0.001)，DTL表达逐步降低(F=116.120，P<0.001)(图1B)。

miR- 490靶向抑制DTL的表达通过网站(http：//www.targetscan.org/vert_72/)查询发现，miR- 490和DTL之间存在结合位点(图2A)。双荧光素酶报告分析显示，与miR- 490过表达对照组相比，miR- 490模拟物和pGL3-DTL Wt共转染后，miR- 490过表达模拟物组荧光素酶活性显著降低(t=7.762，P=0.016)(图2B)。qRT-PCR检测结果显示，与miR- 490过表达对照组相比，miR- 490过表达模拟物组的miR- 490 mRNA表达显著升高(t=13.319，P<0.001)，DTL mRNA表达显著降低(t=7.415，P=0.002)；与miR- 490沉默阴性对照组相比，miR- 490沉默组细胞中miR- 490表达显著降低(t=9.523，P=0.001)，DTL mRNA的表达显著升高(t=11.305，P<0.001)(图2C)。Western blot检测结果显示，与miR- 490过表达对照组相比，miR- 490过表达模拟物组的DTL蛋白表达显著降低(t=7.953，P=0.001)；与miR- 490沉默阴性对照组相比，miR- 490沉默组细胞中的DTL 蛋白表达显著升高(t=10.552，P<0.001)(图2D、2E)。经葛根素处理后，qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，葛根素组细胞miR- 490表达显著升高(t=10.255，P=0.001)，DTL mRNA表达显著降低(t=6.682，P=0.003)；与葛根素+miR- 490阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物组细胞中miR- 490表达显著降低(t=10.995，P<0.001)，DTL mRNA表达显著升高(t=12.478，P<0.001)；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL沉默质粒组细胞miR- 490表达差异无统计学意义(t=1.081，P=0.341)，DTL mRNA表达显著降低(t=14.321，P<0.001)(图2F)。Western blot检测结果显示，与葛根素+miR- 490阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物组DTL蛋白表达显著升高(t=11.423，P<0.001)；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL沉默质粒组细胞的DTL蛋白表达显著降低(t=12.080，P<0.001)(图2G、2H)。

DTL：E3泛素连接酶

Mr：相对分子质量

葛根素通过miR- 490/DTL抑制非小细胞肺癌细胞增殖CCK- 8法检测结果显示，与对照组相比，葛根素组细胞增殖能力显著降低(F=129.27，P<0.001)；与葛根素+miR- 490阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物组细胞增殖能力显著升高(F=75.12，P<0.001)；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL沉默质粒组细胞增殖能力显著降低(F=52.59，P<0.001)(图3)。

葛根素通过miR- 490/DTL抑制非小细胞肺癌细胞迁移Transwell检测结果显示，与对照组相比，葛根素组细胞迁移能力显著降低(t=8.963，P=0.001)；与葛根素+miR- 490阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物组细胞迁移能力显著升高(t=12.117，P<0.001)；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL沉默质粒组细胞迁移能力显著降低(t=12.934，P<0.001)(图4)。

葛根素通过miR- 490/DTL抑制非小细胞肺癌细胞侵袭Transwell检测结果显示，与对照组相比，葛根素组细胞侵袭能力显著降低(t=4.710，P=0.009)；与葛根素+miR- 490阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物组细胞侵袭能力显著升高(t=13.264，P<0.001)；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL沉默质粒组细胞侵袭能力显著降低(t=13.476，P<0.001)(图5)。

与对照组比较，aP<0.001；与葛根素+miR- 490阴性对照组比较，bP<0.001；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组比较，cP<0.001

葛根素通过miR- 490/DTL抑制非小细胞肺癌细胞上皮细胞-间充质转化进程为进一步研究葛根素通过miR- 490/DTL对非小细胞肺癌上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程的影响，本研究采用Western blot检测EMT的标志因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达，结果显示，与对照组相比，葛根素组E-cadherin蛋白表达显著升高(t=7.137，P=0.002)，N-cadherin(t=8.828，P=0.001)和Vimentin蛋白表达(t=6.594，P=0.003)显著降低；与葛根素+miR- 490阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物组细胞中E-cadherin蛋白表达显著降低(t=12.376，P<0.001)，N-cadherin(t=13.436，P<0.001)和Vimentin蛋白表达(t=11.467，P<0.001)显著升高；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组相比，葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL沉默质粒组E-cadherin蛋白表达显著升高(t=13.081，P<0.001)，N-cadherin(t=10.835，P<0.001)和Vimentin蛋白表达(t=11.862，P<0.001)显著降低(图6)。

讨 论

葛根素是葛根中含量最丰富的次生代谢产物，且随着对葛根素的深入研究，发现葛根素不仅对退行性神经疾病和心脑血管疾病具有显著疗效，还可发挥抗癌作用[20- 21]。近年来，越来越多的文献报道葛根素在各类癌细胞中的作用。Deng等[22]研究显示，葛根素可下调促肿瘤细胞因子水平，显著降低炎症反应，抑制EMT，进而抑制结肠癌的进展。Yi等[23]研究发现，基于纳米给药系统，体内实验证实葛根素可抑制肿瘤细胞生长。Tao等[24]研究认为，葛根素可干预肺癌干细胞样细胞活力，抑制自我更新和侵袭能力，可作为治疗肺腺癌的候选化合物。此外，葛根素可抑制膀胱癌T24细胞增殖并诱导凋亡，其机制可能与抑制沉默信息调节因子1、p53信号通路有关[25]。有研究报道，葛根素在非小细胞肺癌中同样具有抑癌作用，可抑制非小细胞肺癌迁移和侵袭[26]，但是葛根素在非小细胞肺癌中的调控机制目前尚未明确。本研究采用不同浓度的葛根素处理非小细胞肺癌细胞株A549细胞，结果发现随着处理浓度的升高，A549细胞生长逐步受到抑制。

与对照组比较，a P=0.001；与葛根素+miR- 490阴性对照组比较，bP<0.001；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组比较，cP<0.001

与对照组比较，aP=0.009；与葛根素+miR- 490阴性对照组比较，bP<0.001；与葛根素+miR- 490沉默模拟物+DTL阴性对照组比较，cP<0.001

A.蛋白免疫印迹图；B.上皮细胞-间充质转化相关蛋白E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达

葛根素通常通过调控癌细胞生长、迁移和侵袭相关的分子机制，进而抑制肿瘤细胞的发展。有研究显示，在乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中，可通过调控microRNA的表达，起到抑制肿瘤发展的作用[27- 28]。本研究显示，用不同浓度葛根素处理A549细胞，miR- 490的表达出现明显变化，随着葛根素处理浓度升高，miR- 490表达也随之逐步升高。因此推测在非小细胞肺癌中，葛根素可能通过上调miR- 490的表达，进而影响非小细胞肺癌的生长、侵袭和迁移。miR- 490是目前研究较多的抑癌因子之一，其在胆管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等癌症中均具有抑癌作用[29- 30]。Gu 等[31]研究表明miR- 490在肺癌细胞中表达显著下调，并且具有抑制肺癌细胞增殖的作用。

为证实这一推测，对细胞进行葛根素与miR- 490抑制物联合处理，并检测处理后的A549细胞生长、迁移和侵袭的情况，结果显示，miR- 490抑制后，葛根素对A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用被显著阻断，由此表明葛根素可通过上调miR- 490的表达，进而抑制非小细胞肺癌生长、侵袭和迁移。

DTL已被证实是一种潜在的促癌因子[32]。Perez-Pea 等[33]研究表明，DTL在乳腺癌和肺癌中的表达均显著升高。本研究通过生物信息学筛选发现，miR- 490与DTL之间存在结合位点，因此推测DTL可能是miR- 490新的靶基因。双荧光素酶报告初步显示，miR- 490与DTL之间存在靶向关系。通过对miR- 490抑制联合DTL沉默处理证实，miR- 490可通过抑制DTL的表达，抑制非小细胞肺癌的生长和迁移。

综上，本研究结果显示，在非小细胞肺癌中，葛根素可通过上调miR- 490的表达，靶向抑制下游靶基因DTL的表达，进而抑制非小细胞肺癌生长和迁移。