末端结合蛋白1的生物信息学分析

唐陶

（川北医学院医学检验系，四川 南充）

0 引言

末端结合蛋白1（human end-binding protein 1,EB1），由微管关联蛋白RP/EB家族成员1（microtubuleassociated protein RP/EB family member 1,MAPRE1）基因编码,为末端结合蛋白家族重要成员之一。EB1蛋白定位于生长中的微管末端，可以招募其他微管相关蛋白，在微管组装和微管动态性调节过程中发挥着极其重要的作用，参与有丝分裂、细胞迁移、细胞形态形成等以微管为基础的细胞活动。研究报道EB1在多种癌症组织（胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、食道鳞状细胞癌）过表达[1]，不仅预示着肿瘤的发展及预后，也影响化疗敏感性，可作为肿瘤诊断、治疗、预后标志物及治疗靶标。本研究利用生物信息学技术对人EB1蛋白进行了结构和功能方面的分析，为进一步研究EB1蛋白在肿瘤中的分子功能提供思路。

1 材料

分别在NCBI-gene数据库和Uniprot数据库中检索人EB1基因及蛋白，其GENE ID为：22919，mRNA序列号：NM_012325.3（GI号：1519311506），EB1蛋白氨基酸序列号：NP_036457.1(GI号：6 912494；Uniprot检索号：Q15691)。

2 方法

2.1 EB1蛋白理化性质分析

利用ORFfinder查找人EB1开放阅读框。在ProtParam数据库（https://web.expasy.org/protparam/）分析EB1蛋白分子量、酸碱性和不稳定指数等理化性质。利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在线工具分析EB1蛋白的亲水性和疏水性（window size为15）。

2.2 EB1信号肽、跨膜结构、磷酸化修饰位点及亚细胞定位分析

分别利用SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、NetPhos 3.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测EB1信号肽及跨膜结构及磷酸化位点。在genecards (https://www.genecards.org/)数据库查询EB1亚细胞定位。

2.3 EB1蛋白结构分析

使用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在线工具预测EB1蛋白二级结构。在pfam(http://pfam.xfam.org/)数据库分析EB1蛋白结构域。SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模法预测EB1蛋白三维结构。

2.4 EB1蛋白互作

通过string网站预测EB1互作蛋白，置信度设置为0.7。在reactome数据库查询EB1参与信号通路。

2.5 EB1在肿瘤中的表达及生存分析

在Gene Expression Display Server查询EB1/MAPRE1在各种肿瘤中的表达水平。利用Kaplan-Meier Plotter绘制生存曲线。

3 结果

3.1 EB1的理化性质

EB1的mRNA序列得到的ORF共21个，最长的为ORF1，共807bp，编码268个氨基酸。ORF1编码序列与EB1氨基酸序列一致。EB1蛋白分子量为29999.08，蛋白质的总分子式为C1340H2099N355O408S9,原子总数为4211。含有268个氨基酸残基，带负电荷的残基总数为（Asp+Glu）39个，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）31个。理论等电点为5.02,说明蛋白偏酸性。EB1蛋白的不稳定指数为35.16，为稳定型蛋白。EB1蛋白的脂肪指数为81.16，亲水性的平均值为-0.427，说明该蛋白为亲水性蛋白。ProtScale分析结果为EB1蛋白疏水性评分最高为1.1，亲水性评分最高为-1.8。EB1蛋白亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表明EB1蛋白属于亲水性蛋白。

3.2 EB1信号肽、跨膜结构、磷酸化修饰位点及亚细胞定位

SignalP4.1、TMHMM分析结果显示EB1不存在信号肽和跨膜区。NetPhos 3.1预测EB1蛋白磷酸化位点较多，以得分>0.7计，分别为16/155/156/165位的丝氨酸、71/124/268位的酪氨酸和166位的苏氨酸。genecards显示EB1主要定位在细胞骨架、细胞质，置信度评分为5。

3.3 EB1蛋白结构

EB1蛋白二级结构中，无规卷曲和α螺旋占比最高，分别为133个（49.6%）、128个（47.8%）。pfam数据库结果显示MAPRE1蛋白有2个结构域，分别是位于N端的钙调蛋白同源（calmodulin homology，CH）结构域及C端的末端结合蛋白同源（EBH）结构域。CH结构域可介导MAPRE1与微管相互作用。EBH结构域可介导MAPRE1与含有SxIP序列的微管相关蛋白如APC、ACF7/MACF1、CLASP1/2相互作用。SWISS-MODEL软件得到1个EB1三维结构标准模型，该模型与模板1vka.1.A序列相似性100%，该蛋白无配体。

3.4 EB1蛋白互作

String蛋白互作分析按得分>0.9者，共得到10个EB1互作蛋白：MAPRE3、CKAP5、DCTN1、CLIP1、DST、AKAP9、AURKA、AURKB、KIF2C、TUBB。Reactome数据库显示EB1参与6种信号通路，包括细胞周期检测点、有丝分裂间期/前中期/中后期、Rho GTPases通路和Cilium Assembly通路。

3.5EB1在肿瘤中的表达及生存分析

GEDs数据库结果显示EB1在直肠腺癌（rectum adenocarcinoma,READ）、多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、结肠腺癌（colon adenocarcinoma,COAD）、肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）、乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma,BRCA）、食管癌（esophageal carcinoma,ESCA）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma,STAD）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）、胆管癌（cholangiocarcinoma,CHOL）、肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma,LIHC）中高表达；但在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、甲状腺癌（thyroid carcinoma，THCA）等肿瘤中低表达或表达差异不明显。Kaplan-Meier Plotter数据库显示，EB1/MAPRE1高表达乳腺癌、肺癌、胃癌及卵巢癌患者生存率较低表达患者明显下降，差异有统计学意义(P<0.001)。

4 讨论

本研究依托生物信息学分析人EB1蛋白，预测EB1蛋白是偏酸性稳定型亲水性蛋白。EB1蛋白互作蛋白中，MAPRE3编码末端结合蛋白3，该蛋白也是末端结合蛋白家族成员之一，在脑、骨骼肌中高表达，其N端与微管末端相互作用，C端可与APC（adenomatous polyposis coli）同源物APCL相互结合。作为微管末端结合蛋白，EB3定位于微管正极端抑制微管解聚以稳定微管，参与轴突生长和细胞间黏附等生物过程[2]。Kim[3]发现高度微卫星不稳定性胃癌及结肠癌发生MAPRE3基因框移突变（p.Cys182AlafsX31;p.Cys182LeufsX16）频率显著高于低高度微卫星不稳定性，差异具有统计学意义（P=0.001）,但进一步分析发现突变的出现与组织学分级、临床分期、转移及生存期无明显关系。目前关于MAPRE3的报道主要集中在神经系统领域，关于MAPRE3与肿瘤发生发展机制关系还待进一步研究。细胞骨架相关蛋白5（cytoskeleton—associated protein 5，CKAP5),由ch-TOG基因编码，是含有TOG或TOG样结构域微管末端示踪蛋白代表成员之一，但它和EB1蛋白具有不同的微管结合模式。CKAP5可稳定纺锤体微管并可调节中心体微管，促进双极纺锤体的形成。CKAP5的异常表达使中心体微管聚合物显著减少，导致多极纺锤体形成，促进癌症的发展[4]。据报道，CKAP5表达在结肠和肝脏肿瘤较正常组织显著增加。Yu等[5]研究也发现CKAP5在肝细胞肝癌中相较于癌旁组织表达明显增加，且高表达预示着降低的总生存期。DCTN1编码p150glued蛋白，该蛋白可通过N端的CAP-Gly结构域与EB1、EB3结合，参与有丝分裂、纺锤体形成、细胞核定位、胞内大分子的运输和定位等多种生物进程。DCTN1与脊髓侧索硬化症、远端运动神经病变VII B型、佩里综合征的发病有关[6]。CLIP1蛋白N端可与EB1相互作用从而使其定位在微管正末端，C端结构可与P150glued蛋白直接结合，与有丝分裂等细胞功能密切相关。研究发现CLIP1无义突变可能导致智力缺陷的发生，这可能是因为CLIP1参与神经元发育有关[7]。AKAP9编码的AKAP350和AKAP450主要定位于中心体，与微管组装及介导的运动有关。研究发现AKAP9基因突变与胃癌、直肠癌等多种癌症发病有关[8]。Aurora蛋白激酶包含AURKA、AURKB及Aurora-C,这三种Aurora蛋白激酶相互结合，在细胞有丝分裂和减数分裂生物过程中发挥重要作用，研究发现AURKA、AURKB在多种癌症如乳腺癌中高表达，且与预后不良相关[9]。

Dong等[10]发现，EB1在乳腺癌组织呈现高表达状态，同时观察到EB1表达水平与乳腺癌患者组织学分级、临床分期及淋巴结转移明显相关，且影响乳腺癌对紫杉醇化疗敏感性。研究发现EB1在肺癌组织中高表达，EB1阳性肺癌患者总生存期和3年生存率均显著低于EB1阴性肺癌患者[11]。研究发现EB1和AURKB在卵巢癌中阳性表达率显著高于卵巢正常组织，EB1、AURKB阳性表达者卵巢癌患者总生存率明显缩短[12]。上述研究与本文GEDs、Kaplan-MeiMer plotter数据库结果一致。

综上所述，本文通过生物信息学分析人EB1蛋白结构、功能，发现EB1参与肿瘤发生发展预后过程，但由于EB1信号传导极其复杂，参与多条信号通路，了解EB1蛋白分子结构，为研究其与肿瘤发展的许多潜在机制提供新思路。