探讨高效液相色谱法测定硫酸伏拉帕沙原料药中杂质

2021-01-06赵云鹤商丽丽吴迪张伟一

世界最新医学信息文摘 2021年95期

赵云鹤，商丽丽，吴迪，张伟一

(1.吉林省白城市食品药品检验所，吉林白城 137000；2.国家能源集团吉林龙华热电股份有限公司白城热电厂，吉林白城 137000)

0 引言

对于硫酸伏拉帕沙来讲，一般是应用于有心脏病的患者以及下肢动脉栓塞的患者，以此降低动脉粥样硬化现象的发生。相关人员应用顶空气相色谱法对该项原料药内包含的七种有机溶液残留量展开了合理分析，采取HPLC 检验片剂的溶出度，其中，原料药物质性能决定了药品安全性和整体效果的体现，加强药物杂质控制力度是确保药品用药安全性的关键所在。本文主要遵循质量源于设计方面的基本理念，将合成和降解反应机制当成一项基本导向，专门探究了生产期间的杂质情况，将杂质HPLC 检测方式应用于硫酸伏拉帕沙原料药内，经过应用该项可以看出，HPLC 检测方式有着灵活性高的特征，可以快速定量以及定性分析硫酸伏拉帕沙包含的各项杂质，将该项杂质控制在合理范围中，从一定程度上确保硫酸伏拉帕沙原料和制剂药物的整体质量。

1 高效液相色谱法

高效液相色谱法主要是指以高压液体为流动性的液相色谱分析法，该种方式是从上个世纪70 年代初形成的一种新型色谱分离分析技术，本身有着选择性良好、灵敏程度提高、分析速度快、适用范围广等一系列特征，比较适合应用在高沸点、不稳定有机及生化试样的分离分析环节中、采取高压泵将有着一定极性的单一溶液或者是不同比例的混合溶液泵装到填充剂的色谱柱内、被流动相带入色谱柱内加以分离，然后进入检测器，借助记录仪或者数据处理系统记录色谱信号，分析数据获取准确的分析结果，按照固定相的不同可以将高效液相色谱法分为多方面，分别是液色谱法和液固色色谱法。从实际情况来看，高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上形成的现代液相色谱，和经典液相色谱没有明显的区别，不同点是现代液相色谱和经典液相色谱相比较来看效率极高，能够达到自动化操作的目的，高效液相色谱的原理与经典液相色谱是相同的，不过它采用了高效色谱柱高压输液泵以及灵敏度的检测器等，因此可以进一步提升高效液相色谱的分离效率分析速度以及灵敏度，在借助计算机技术的基础上逐渐发展成为了自动化和智能化的现代分析仪器，虽然气相色谱法是一项较好的分离和分析方式，有着分析速度快和分离效能好的特征，然而从实际情况来看，气相色谱法只可以分析处于操作温度下可以气化而不分解的物质。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上引用了气相色谱的理论，在技术上将流动相改为高压输送，其中，最高输送压力可达29.4MPa，色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效远远高于经典液相色谱，每米塔板数可达几万或几十万，并且柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。特点：其一，高压：液相色谱法以液体为流动相，将其称为载液，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了可以快速通过色谱柱，需要对载液施加高压。一般情况下，可以达150~350×105Pa。其二，高速：流动相在柱内的流速和经典色谱相比较来看要快很多，通常可达1~10mL/min。高效液相色谱法所需的分析时间远远少于经典液相色谱法少得多。其三，高效：HPLC 的分离效率远远高于普通液相色谱，在发展过程中又形成了许多新型固定相，促使分离效率全面提高。其四，高灵敏度：高效液相色谱目前广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提升了分析的灵敏度，比如荧光检测器灵敏度可达10-11g。与此同时，用样量小。其五，适应范围普遍且广泛，气相色谱法与高效液相色谱法的比较得出，气相色谱法本身有着分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作便利等一系列特征，可是因为受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都无法应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，根本不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大的有机物原则上都能够采取高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计表明，在已知化合物中，用液相色谱分析的约占70%~80%。

2 实验环节

2.1 采取的仪器、试剂和相关材料

2.2 溶液制备

供试品溶液，称取硫酸伏拉帕沙对照品，准确称定，添加溶液，同时定量稀释制成大约0.5mg/mL 的硫酸伏拉帕沙溶液。选取的对照溶液为精密量取供试品溶液1.0mL 于100mL量瓶内，使用溶液稀释到刻度为止。系统适用性溶液；取各项杂质和适量的硫酸伏拉帕沙对照品，使用溶剂进行溶解，同时定量稀释为1mL 的含硫酸伏拉帕沙大约0.5mg。

3 获取的结果

3.1 系统适用性实验

取出适量的杂质使用溶剂溶解并且定量稀释制成含各杂质的溶液，将其当成一项杂质混合溶液。各项杂质之间的分离度均大于1.5，伏拉帕沙和相邻杂质峰之间的分离度远远高于1.5。

3.2 考察线性关系

取出适量的杂质，进行精密称定，添加50%比例的乙腈溶解到稀释制成大约0.5mg/mL 的溶液，精密量取杂质0.4mL和其他各杂质相互放置于50mL 的量瓶内，

3.3 线性关系考察

取各杂质适量，精密称定，加50%乙腈溶解并稀释制成约0.5mg/mL 的溶液，精密量取杂质D0.4mL 与其余各杂质各1.0mL 置同一50mL 量瓶中，用溶剂稀释至刻度作为储备液，精密量取储备液0.2、0.5mL，分别置20mL 量瓶中，加溶剂稀释至刻度作为各线性溶液。杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G，均不在0.9~1.1 之间。

3.4 定量限和检测限

取系列标准溶液，逐级稀释，当S/N=10 时，即为定量限；当S/N=3 时，即为检测限。

3.5 精密度实验

对于不同的实验人员来讲，在不同时间采取不同的仪器重复测定供试品。举例说明，在12 份供试品中，杂质A,E,G的检出量均为0.01%，杂质B 均为0.10%，杂质C,D,F 及异构体杂质D,E,F 均没有检出，总杂质为0.16%，精密度良好。

3.6 溶液稳定性

处于良好的常温状态放置24h，与0h 相比较来看，供试品溶液杂质检出量基本没有发生任何的变化变化，对照溶液峰面积RSD 为0.70%(规定＜2.0%)。供试品溶液与对照溶液24h 内稳定。

3.7 回收率

按照实验方法，测定9 份样品的杂质A,B,C,D,E,F,G 和异构体杂质D,E,F 的回收率依次为100.3%、8.4%、102.2%、100.6%、97.6%范围内，RSD 最大为3.2%(＜10.0%)使用该项方式产生的优势极高。

按2～2.5米分厢，以便于田间管理为度，将畦面整平。如畦面不平易造成播种深度和田间水层不均衡，影响种子出苗生长。

3.8 耐用性体现

将检测色谱条件分别展开适当的变动，比如乙腈初始比例25%+2%、柱温30C+5C、水相中含磷酸量(0.1%+0.02%)基于合理条件下来看，分离度和标准要求相一致，样品杂质个数和含量没有发生明显的改变，这从一定程度上体现出了良好的耐用性。

3.9 检验样品

当前阶段，对不同批号样品进行详细测定，杂质和异构体杂质没有检出。通过采用二极管阵列检测器检测各成分的吸收曲线，清楚的了解到了各杂质在260nm 波长处均存在着最大吸收和良好的灵敏度，因此，可以选择260nm 当成一项检测波长。对于流动相中的缓冲盐体系，全面比较0.1%三氟乙酸溶液、0.05%溶液等，各项杂质之间的分离度不符合规定，在pH2.5PBS 溶液条件下，各杂质有着良好的分离度。

4 相关要点

4.1 明确色谱条件

当前阶段，创建色谱条件的重点在于专属色，一般情况下，采取在被测物对照品中添加相应比例的杂质以及辅料，以此检验选择的色谱条件是否可以有效分离各项杂质以及被测物，依照1%比例的被测物浓度各杂质量添加到被测物内，对被测物内存在的杂质情况进行模拟，也就是说，存在着少量杂质的情况下，能够和被检测物达到有效分离，从而检验系统自身性能，最终将被测物的实际情况清楚以及客观的体现出来。

4.2 选取检验波长

杂质是物质检测的一项主要对象，而非检测物，不过在测定工作实施期间，主要是根据峰面积加以表达，因此在选择波长期间，必须综合性考虑被检测物和各项杂质基于检验波长的基础上校正因子是否相同，需要配置相应浓度的被测物和各杂质溶液，采取紫外扫描的方式以吸光度相近的波长当成检验波长，在该项检验波长的基础上分别实施相关检测工作，各峰面积计算出校正因子，举例说明，在f 为0.8~1.2 的情况下，说明被检测物和各项杂质的F 相同。通常情况下，将被测物的最大吸收波长当成检测波长，不加校正因子的计算方式，而没有综合考虑各项杂质F。

4.3 确定供试品溶液浓度

对于供试品溶液浓度的检验也有着极为关键的作用，虽然浓度较高的情况下可以将被测物杂质存在现象有效体现出来，不过一旦设置太高的话，将会形成严峻的主峰拖尾问题，形成检测器超载等不良情况。而设置较低的时候，灵敏度不足，难以有效对杂质和含量变化加以检验。

4.4 线性实验

一般来讲，对杂质设定是该项杂质的100%浓度，线性验证范围10%~150%，也就是说，被测物测定浓度的1.0%-1.5%，而且精密度实验和标准要求相符合，依照实际情况适当放宽到5.0%。

4.5 加样回收率试验

对于回收率试验来讲，主要是应用基于已知杂质含量的被测物内添加相应定量杂质的方式加以评价，把各项杂质以1%的浓度添加到被测物溶液内，检验采取的色谱条件能否分离检测杂质以及被测物品中存在的杂质是否累加等，了解到测量加量的准确性。

4.6 强力破坏试验

实施强力破坏试验的主要目的是为了体现出原料药的内在稳定性，是基于研究背景下非常重要的一方面，该项试验是从比加速试验剧烈条件下实施，其中涉及到了样品在销售以及运行期间存在的复杂聚类现象，从而检测剧烈条件中形成的杂质。

4.7 确定其他色谱参数

其一，选择流速，主峰保留时间为10min 以后。其二，选择溶剂。通常选流动相作溶液，在流动相溶解性不佳的情况下将甲醇当成溶液。其三，设定色谱图记录时间，需要将存在的全部杂质和经过强力破坏试验形成的杂质，至主成分保留时间的几倍为止。其四，设定积分参数。色谱峰峰面积大小是由斜率和峰宽两方面参数加以决定，在斜率非常大的情况下，切线的倾斜角非常大，峰面积越小发的话，峰宽通常无可以遵循的规律。另外，最小峰面积是非常重要的一项参数，该项参数设定越大，杂质峰将不容易被积分检验出来，被测物杂质含量符合要求。

5 讨论

5.1 二极管陈列检测器应用价值的体现

DAD 检测器是对色谱峰的实施紫外扫描工作，结合所得图谱进行相关比较，有效评价峰纯度。不过从实际应用现状可以看出，该项检测器功能有一定的局限性存在，只有在杂质紫外扫描图谱与主成分紫外描图谱有着一定差别的情况下，才可以体现出极高的辨别效果，发挥出应有的作用。

5.2 质量标准中的系统适用性试验

以被测物浓度1%来验证被测物峰最难分离的杂质，从而体现出即时试验的专属性。

5.3 自身对照法和归一化法的区别分析

当前阶段，将供试品溶液稀释100 倍后，获取的1%对照溶液主峰面积应为供试品溶液主峰面积的1/100，当两者差别非常大的情况下，就从一定程度上说明了稀释100 倍后主峰峰面积不呈线性，这就需要采用自身对照法，而获取的测定数据相同时，可以将归一化法应用于稳定性试验中。不过在质量标准中仍建议拟定为自身对照法。

5.4 HPLC 法检测药品杂质的优缺点体现

HPLC 法主要是在反相色谱上对被测物进行精准检测，产生的优势良好，作用极高，不过需要正确认识到的一方面是，过于盲目、片面采用HPLC 法的做法是不可取的。只有将在正相色谱中检测被测物的TLC 法全面结合到一起，有效分析以及比较，遵循取长补短的基本原则，才可以从中获取准确程度高的杂质数据，以此更加清楚和客观的体现出有关结果。