银杏内酯A通过p38MAPK通路减轻中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症

王蓓蓓 徐芳 王爱利

支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病，以气道高反应、气道粘液高分泌为特征，随着病程的发展，可出现气道重塑、肺组织结构性改变。尽管大部分哮喘对糖皮质激素治疗敏感，仍有5%～10%重症哮喘对糖皮质激素治疗反应差，增加了非计划门诊、急诊或住院率，严重者甚至会导致患者死亡[1]。中性粒细胞在重症哮喘中发挥重要作用[2]，研究表明，在中性粒细胞为主的气道炎症中，伴随氧化应激的病理过程[3]，且中性粒细胞与氧化应激关系密切。在McGovern等的研究中发现，气道氧化应激产物与中性粒细胞在气道的聚集与气道高反应、气道炎症的形成有关，经抗氧化治疗可阻止中性粒细胞趋化引诱物的合成及释放，并减轻气道炎症及气道高反应[4]。银杏内酯A是一种从银杏叶(Ginkgo biloba L)中分离而来的中药成分，目前研究发现银杏内酯A具有抗炎、抗氧化、减轻冠状动脉内皮功能失调及神经元毒性保护作用[5-7]，基于银杏内酯A的抗氧化、抗炎作用，我们通过中性粒细胞性哮喘模型探索GA对中性粒细胞为主的哮喘小鼠气道炎症的影响及作用机制，为重症哮喘提供新的治疗策略。

资料与方法

一、材料

BALB/c小鼠，雌性，6～8周，20～25 g，SPF级，购于湖北省实验动物研究中心，动物合格证号：SYXK(鄂)2016-0057，小鼠于SPF级动物实验环境中饲养，保证饮食充足，12小时光照、12小时黑暗循环，动物实验获本院伦理委员会审查批准。卵清蛋白(OVA)(grade V, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA)，银杏内酯A、FCA(Sigma，USA)，DEX(天津金耀氨基酸有限公司)，SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗β-actin抗体(天津三箭生物技术有限公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(Aspen，USA)，兔抗磷酸化的ERK1/2抗体、兔抗磷酸化的p38抗体、兔抗磷酸化的p85抗体均购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司。

二、方法

1 哮喘模型建立及给药干预

28只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组、GA干预组、DEX干预组。哮喘组、GA干预组及DEX干预组分别于第0、14、21天腹腔内注射20 ug卵清蛋白(OVA)+75 ul 氟氏制剂(CFA)致敏，从第22天开始直至第24天连续给予5% OVA雾化激发，每次激发30分钟，一天一次，对照组给予PBS致敏及激发。GA干预组及DEX干预组每次激发前1小时给予80 mg/kg GA[8]或1 mg/kg DEX腹腔注射。

2 肺泡灌洗液细胞分析

末次激发后24小时，获取各组小鼠肺泡灌洗液，参照先前的实验方法[9]，即使用0.8 mL经4℃预冷的PBS进行双侧肺泡灌洗，共灌洗三次，每次灌洗后200 g，4℃条件下离心5分钟。将三次细胞沉淀浓度调制1×106/mL，通过细胞计数板进行细胞总数计数，然后取200 μL细胞溶液进行迪夫快速(Diff-quick)染色，显微镜下取10个不同视野进行细胞分类计数。

3 肺泡灌洗中SOD的检测

获取第一次肺泡灌洗液(BALF)上清，使用SOD试剂盒检测BALF中SOD水平，详细操作步骤参照试剂盒说明书进行。

4 肺组织学检测

末次激发24小时后，剪开胸壁，于右肺门处结扎右肺，通过2 ml注射器针头(去掉尖端部分)将200 ul 10%中性多聚甲醛注入左肺，使其膨胀。于左肺门处结扎，获取左肺，10%多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋。沿左肺长轴切片，切片厚5 um，制片，脱蜡，苏木精-伊红(HE)染色、糖原(PAS)染色，光镜下观察气道周围炎症及气道内粘液分泌变化。

5 Western blot检测

提取各组小鼠右肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度并进行相对定量，使各样品总蛋白浓度一致。行SDS-PAGE，转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h，洗涤，分别加1:1000稀释的兔抗p-ERK1/2抗体、兔抗p-p38抗体、兔抗p-p85抗体、兔抗β-actin抗体4℃孵育过夜，洗涤，HRP标记的山羊抗兔二抗(1:4000)室温孵育1h，TBST洗膜，ECL试剂盒化学发光法显示蛋白条带，图像分析软件测定蛋白条带的吸光度值。

三、统计分析

所有资料通过GraphPad Prism 5进行统计绘图。所得数值以`x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异有显著性时进一步运用S-N-K法进行两两比较，P<0.05，表示平均值差异具有统计学意义。

结 果

一、GA减少中性粒细胞哮喘小鼠肺泡灌洗液中，中性粒细胞计数

末次激发后24小时进行肺泡灌洗液细胞总数及细胞分类计数，结果显示哮喘组细胞总数、中性粒细胞计数及嗜酸性粒细胞计数均较对照组明显升高，经GA干预后哮喘小鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞计数均明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。而DEX干预组上述指标变化不明显(P>0.05)(见表1)。

表1 GA减少中性粒细胞为主的哮喘小鼠BALF中白细胞总数及中性粒细胞计数(n=7,×104/L)

二、GA减轻中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症

为了探索GA对哮喘小鼠气道周围炎症细胞聚集及粘液分泌的影响，我们对各实验组小鼠肺组织进行H&E染色、PAS染色。哮喘组小鼠气道及血管周围可见明显白细胞浸润、胶原纤维沉积及粘液分泌，GA干预后哮喘小鼠气道及血管周围炎症明显减轻、杯状细胞增生及粘液分泌明显减少，而地塞米松干预组气道及血管周围炎症变化不明显(见图1)。

图1 各实验组小鼠肺组织H&E染色、PAS染色哮喘组气道周围可见明显炎性细胞浸润，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞的聚集增加(黑色粗箭头)，粘液分泌增加(黑色细箭头)，杯状细胞增生(红色细箭头)，气管壁明显增厚；GA干预组气道周围炎症细胞聚集明显减少、黏液分泌细胞,杯状细胞增生明显减少，DEX干预组气道及血管周围炎症上述变化不明显。(×200)

三、GA降低了中性粒细胞性哮喘小鼠BALF中SOD水平

SOD是一种氧化应激产物，为了解GA对气道氧化应激的影响，我们通过Elisa检测了每组小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)中SOD水平。结果表明，哮喘组BALF中SOD水平较对照组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。经GA干预后，哮喘小鼠血清SOD水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而DEX干预组SOD水平变化不明显(见图2)。

图2 GA对哮喘小鼠BALF中SOD活性影响

四、GA对p38、ERK和p85活化的影响

结果显示，哮喘组小鼠肺组织中p38被激活，其蛋白表达量较对照组明显升高，经GA干预后p38/MAPK通路的活化明显被抑制，差异有统计学意义，P<0.05。地塞米松干预组p38蛋白表达量无明显变化，P>0.05。而p85和ERK的活化与对照组比较，差异无统计学意义，P>0.05(见图3)。

讨 论

支气管哮喘是一个慢性气道炎症性疾病，目前全世界约有3亿哮喘患者，每年约有25万人因哮喘而过早地死亡。氧化应激在哮喘的病理过程中扮演重要的角色，因氧化应激过程中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平明显增加[10]，从而导致氧化与抗氧化失衡，过多的ROS引起血管通透性增加，粘液高分泌，平滑肌收缩，气道上皮脱落、损伤及气道高反应[11-12]。SOD是一种对抗ROS的抗氧化物，在哮喘患者中SOD的活性明显下降，且SOD活性下降与气流受限程度及哮喘严重程度明显相关[13-14]。与文献报告一致，本实验研究中也发现哮喘小鼠BALF中SOD水平较对照组明显下降，提示哮喘小鼠炎症部位SOD大量消耗，氧自由基清除能力下降。

图3 GA对P38、ERK、P85活化的影响

银杏内酯A是银杏叶提取物中重要的活性物质，在多种疾病模型中显示了良好的抗炎、抗氧化作用。郝艳玲等通过细胞水平缺血再灌注模型发现，银杏内酯A可以增加SOD、减少乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平，降低心肌缺血再灌注的损伤程度[15]。Tosaki等研究表明联合SOD和银杏叶提取物(EGB761)可以明显减少自由基的产生及再灌注导致的室颤(ventricular fibrillation,VF)和室速(ventricular tachycardia,VT)的发生[16]。本实验研究也表明，在中性粒细胞性哮喘模型中，哮喘小鼠经银杏内酯A干预后SOD水平明显上升，并伴随着气道周围炎症的减轻，而地塞米松干预组SOD及气道周围炎症变化均不明显，提示了银杏内酯A具有抗氧化作用，可能通过提高SOD水平，维持氧自由基生成与清除的动态平衡，从而对中性粒细胞性哮喘产生治疗作用，为减少激素的抵抗提供了新的治疗策略。

MAPK是高度保守的真核生物信号转导酶，包括JNK、ERK、p38，受不同的细胞外刺激，如细胞因子、激素、应激等激活后，可将信号传导至细胞核内部，调节细胞生长、分化、氧化应激和炎症反应。其中ERK参与了哮喘气道重构过程[17]，p38在介导糖皮质激素抵抗型哮喘病理过程中发挥重要作用[18]，p38MAPK活化程度与糖皮质激素治疗的反应性及哮喘的临床严重程度相关[19]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)由一个催化亚基(p110)和一个调节亚基(p85)构成，参与气道平滑肌增生及气道重构过程。研究表明，p85在气道上皮及气道平滑肌中表达明显增加，并与气道平滑肌增生相关[20]。为了探索银杏内酯A对中性粒细胞性哮喘的治疗机制，我们检测了各组肺组织中ERK、p38及p85活化后的蛋白表达情况，Western-blot结果分析显示哮喘组p-p38含量较对照组明显增加，而p-ERK及p-p85无明显变化。经银杏内酯A干预后肺组织中p-p38的表达明显下降，提示了p38MAPK信号途径参与了银杏内酯A对中性粒细胞性哮喘的抗炎作用过程。

综上所述，银杏内酯A通过p38MAPK途径调节中性粒细胞性哮喘气道炎症及氧化应激过程，对中性粒细胞性哮喘具有治疗作用，为临床重症哮喘治疗提供了新的依据，对减少激素的使用及其副作用具有重要意义。但银杏内酯A调节p38MAPK的具体分子机制尚不明确，有待下一步体内及体外实验进一步探讨。