黄葵四物方对尿毒素分子硫酸对甲酚在宿主细胞内代谢通路及转运环节的影响

陆静波，王颖异，彭 印，徐雪君，陈晨凯，段金廒，郭建明*

黄葵四物方对尿毒素分子硫酸对甲酚在宿主细胞内代谢通路及转运环节的影响

陆静波1, 2，王颖异1, 2，彭 印1, 2，徐雪君1, 2，陈晨凯1, 2，段金廒1, 2，郭建明1, 2*

1. 南京中医药大学 江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023 2 南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023

探讨黄葵四物方对尿毒素分子硫酸对甲酚（-cresyl sulfate，PCS）在宿主细胞内的代谢通路及转运环节的影响，并初步探讨其作用机制。采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪（ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/mass spectrometry，UPLC-TQ/MS）检测黄葵四物方干预后血浆及脏器内PCS水平的变化。采用酶活法检测肝脏内PCS合成酶磺基转移酶的活力。采用qRT-PCR及Western blotting检测结肠和肝脏中磺基转移酶及肾脏中有机阴离子转运体的基因转录和蛋白表达水平。黄葵四物方可降低动物血浆或肝脏中PCS水平。黄葵四物方显著下调肝脏内磺基转移酶基因转录和蛋白表达水平（＜0.05），抑制肝脏中对甲酚向PCS转化，从而抑制宿主体内尿毒素分子PCS的合成。黄葵四物方不影响肾脏中有机阴离子转运体的基因转录和蛋白表达水平，不影响PCS由血液向肾脏中的转运过程。黄葵四物方可通过调控宿主细胞内PCS的合成途径，抑制PCS体内合成，减少尿毒素蓄积，从而延缓慢性肾病进程。

慢性肾病；尿毒素；硫酸对甲酚；黄葵四物方；磺基转移酶；有机阴离子转运体

慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）是一个世界性的公共卫生问题，全球发病率约为10%，其中20%～30%的患者将会发展为终末期肾病，造成巨大的社会和经济负担[1-2]。全球疾病负担研究表明，预计到2040年，CKD将成为导致人类死亡的第5大原因[3]。随着CKD进展，肾功能不断衰竭，体内代谢产生的氮质废物不能及时排出体外，在体内不断堆积形成的对机体有毒性的物质称作尿毒素。按照相对分子质量及物理化学特性，可以将尿毒素分为小分子质量尿毒素（如肌酐/尿素氮）和中分子质量尿毒素（如甲状旁腺素）和蛋白结合型尿毒素[4]。其中，蛋白结合型尿毒素因与血浆蛋白结合率高而命名，其相对分子质量大，临床透析治疗不能将其去除，在终末期肾病患者体内大量堆积，极大地降低了CKD患者的生活质量和存活率[5]。

硫酸对甲酚（-cresol sulfate，PCS）是蛋白结合率高达95%的蛋白结合型尿毒素，终末期肾病患者体内PCS含量超出正常人10倍[6]。过量的PCS在CKD患者体内蓄积，进一步加剧肾脏和心血管的损伤，加快CKD的进展。PCS具有肾毒性，可诱导肾脏纤维化，加剧肾脏炎症反应[7]，诱导肾小管细胞及肾小管近端细胞的凋亡，增加CKD患者的发病率和死亡率[8]。在心血管系统，PCS可刺激血管内皮微粒子释放，诱导血管内皮细胞损伤，同时，可诱导内皮细胞和血管平滑肌细胞的氧化应激，加剧CKD患者的血管损伤[9]。

中药被认为是一种成本低、效益高的治疗手段，几十年来，中药治疗慢性重大疾病的有效性和安全性研究取得了很大的进展，越来越多的患者受益于中药。本课题组在临床治疗CKD药物黄葵胶囊的基础上，进一步优化得到中药复方黄葵四物方。该复方是由黄葵、黄芪、虎杖和姜黄4味中药配伍而成。组方具有清利活血、通淋消肿、补泻同施、标本兼顾之功。本课题组前期研究发现，黄葵四物方可显著减轻CKD模型大鼠的肾脏炎症及纤维化水平；显著抑制CKD模型大鼠血浆、肝脏和肾脏中尿毒素分子PCS的蓄积[10]，提示黄葵四物方保护CKD的作用可能与其抑制体内PCS蓄积相关。

PCS在宿主体内合成及转运过程主要包括2个环节。PCS的合成环节：食物中的酪氨酸被肠道菌群分解产生对甲酚，对甲酚可在结肠和肝脏内被磺基转移酶（sulfotran-sferase1a1，SULT1A1）代谢合成PCS；PCS的转运环节：血浆中的PCS经由肾脏阴离子转运体（organic anion transporter，OAT）转运进入肾脏细胞并最终通过尿液排泄[8]。最新研究表明，中药通过干预肠道菌群可有效改善CKD、心血管疾病等多种慢性疾病[11-14]。本课题组前期研究发现黄葵四物方可作用于肠道菌群，调控肠道菌群中PCS前体分子对甲酚的合成途径，抑制肠道菌群中对甲酚的合成。然而，黄葵四物方是否影响PCS在宿主细胞中的合成环节以及向肾脏内的转运环节尚不清楚。因此，本研究进一步探究黄葵四物方对尿毒素PCS在宿主细胞内的合成及转运环节的影响。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

ChemiDocXRS凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；7500 Real Time PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；超高效液相色谱三重四极杆质谱联用（Ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/mass spectrometry，UPLC-TQ/MS）和高效液相色谱-紫外-荧光检测器（high performance liquid chromatography-ultraviolet/fluorescence detector，HPLC-UV-FLD）均购自美国Waters公司；Microcl 21R常温低速离心机（Thermo公司）。

1.2 实验动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量18～25 g和SPF级SD雄性大鼠，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（北京）2015-0001，动物合格号：NO.201807103。动物饲养在室温20～26 ℃，相对湿度40%～70%，光照约12 h明暗交替的屏障环境动物房。每日提供符合标准的动物饲料及饮用水，供动物自由摄食和饮水。动物研究遵循南京中医药大学动物伦理委员会的指导方针（伦理审核号201805A002）。

1.3 药物及试剂

黄葵（批号180901）、黄芪（批号180401）、虎杖（批号180501）、姜黄（批号180201）均购于安徽省万生中药饮片有限公司，经南京中医药大学段金廒教授鉴定，符合《中国药典》规定，均为正品。对甲酚（批号BCBR6678V）、PCS（批号3233-58-7）和腺苷-3′-磷酸-5′-磷酰硫酸锂盐水合物（adenosine-3′-phosphate-5′-phosphate lithium phosphate，PAPS，批号101154-201001）均购于美国Sigma- Aldrich公司。氯霉素（批号F1805109）、苯巴比妥钠（批号2015062）购于中国材料研究中心。生理盐水购于山东齐都药业有限公司。Trizol试剂和引物购于美国Thermo Fisher Scientific公司；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和TransStart Top Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司。抗体购于美国Proteintech公司。质谱级乙腈购于德国Merck公司。质谱级甲酸购于天津科密欧有限公司。

2 方法

2.1 黄葵四物方溶液的制备

称取适量黄葵、黄芪、虎杖、姜黄粉末，按照3.5︰5︰1.5︰1的比例混匀，60%乙醇提取3次，每次1.5 h，提取液合并进行浓缩，浓缩后生药量2 g/mL，其中主要药效成分质量分数分别为毛蕊异黄酮苷0.35 mg/g、虎杖苷2.54 mg/g、金丝桃苷3.90 mg/g、异槲皮苷2.56 mg/g、槲皮苷0.29 mg/g、杨梅素0.85 mg/g、白藜芦醇13.42 mg/g、毛蕊异黄酮0.22 mg/g、槲皮素0.06 mg/g、姜黄素1.25 mg/g、大黄素0.54 mg/g。

2.2 PCS的UHPLC-TQ/MS分析

2.2.1 色谱条件 采用Acquity UHPLCTM系统、Acquity UHPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7mm）进行色谱分析。流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），具体色谱参数见表1。

2.2.2 质谱条件 采用Xevo Triple Quadrupole Mass Spectrometer（TQ/MS）、选择性反应检测法进行质谱分析。检测参数：毛细管电压为3.0 kV，离子源温度为150 ℃，脱溶剂温度为550 ℃，锥孔气流速度为50 L/h，脱溶剂气体积流量为1000 L/h。PCS质谱检测条件见表2。

表1 UPLC-TQ/MS检测PCS的色谱条件

表2 UPLC-TQ/MS检测PCS的质谱条件

2.3 黄葵四物方对宿主体内PCS合成的影响

2.3.1 黄葵四物方对小鼠体内PCS含量的影响 将10只C57BL/6雄性小鼠随机分为2组，分别为正常组和黄葵四物方组，每组5只。对照组小鼠ig无菌超纯水，黄葵四物方组小鼠ig黄葵四物方水溶液（2.5 g/kg[10]），连续ig 28 d。第28天，对照组和黄葵四物方组小鼠ig对甲酚（80 mg/kg），2 h后进行眼眶取血。实验结束后，将小鼠用苯巴比妥钠（0.1 mL/10 g）麻醉，采集小鼠结肠和肝脏，脱颈椎处死小鼠。

将血液样品4000 r/min离心10 min，离心后取上清即得血浆。称取脏器样品于EP管内，每克样品加入1 mL PBS溶液，60 Hz，90 s匀浆后，13 000 r/min离心10 min，取上清。所有样品以10∶1比例加入200 μg/mL氯霉素作为内标物，再以1∶3比例加入乙腈，充分混匀，13 000 r/min离心10 min，取上清至进样小瓶中，置于冰上。按照“2.2”项的方法测定PCS含量。

2.3.2 黄葵四物方对小鼠肝脏中SULT1A1活性的影响 实验分组和给药同“2.3.1”项。称取各组小鼠肝脏，按1∶4（mg/L）的比例加缓冲溶液（将5 mmol/L的MgCl2·6H2O溶解在100 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl中），2颗钢珠，60 Hz、90 s匀浆，4 ℃，13 000 r/min离心20 min，取上清液。将上清液在37 ℃中孵育3 min，取240 μL上清液加10 μL 250 mol/L PAPS（3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸，底物，为对甲酚提供硫酸基团，促进对甲酚合成PCS），37 ℃孵育0、5、30、60 min，孵育完成后，加0.3 mL甲醇终止反应。涡旋后离心（12 000 r/min、10 min），取上清液至进样小瓶。通过HPLC-UV-FLD分析上清液中PCS含量，采用C18柱（250 mm×4.6 mm，5mm，Alltima，美国），柱温为35 ℃，进样时间为5.5 min，波长为260～300 nm，流动相为乙酸铵-乙腈（75︰25）。通过计算单位时间内PCS生成量反映小鼠肝脏中SULT1A1的酶活性。

2.3.3 黄葵四物方对小鼠结肠和肝脏中SULT1A1 mRNA和蛋白表达的影响 实验分组和给药同“2.3.1”。将小鼠结肠、肝脏组织置于Trizol试剂中进行研磨裂解，12 000×离心10 min，取上清，加入氯仿萃取静置分层，12 000×离心15 min，取最上层溶液，加入异丙醇充分混匀，静置，12 000×离心10 min，弃上层液体，加入75%乙醇涡旋，7500×离心5 min，取上清，3次，弃去液体，倒扣晾干，加入DEPC水复溶mRNA，并按照逆转试剂盒说明书获得互补DNA（complementary DNA，cDNA）。使用PCR基因扩增仪进行扩增。PCR反应每个样品进行3次重复实验，PCR扩增反应条件为94 ℃预变性30 s，然后进入循环阶段，每个循环包括94 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。最终以目的基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的含量比值表示目基因的表达水平。使用的引物序列见表3。扩增数据按照2−ΔΔCt的方法进行数据处理。

将小鼠的结肠、肝脏组织用RIPA裂解液以及蛋白酶抑制剂Cocktail进行裂解，蛋白浓度用BCA试剂盒（Pierce Protein Biology，Rockford，IL，美国）进行检测。配制浓缩胶和10%的分离胶，并加入相同蛋白含量的样品进行样品分离，用PVDF膜转膜。5%牛奶室温封闭PVDF膜1 h，封闭后用SULT1A1抗体（1︰1000）稀释，4 ℃过夜孵育，然后用对应的二抗进行孵育，曝光，获得目的蛋白及内参蛋白（α-tubulin）的灰度值。

2.3.4 黄葵四物方对大鼠体内PCS合成环节的影响 将15只SD雄性大鼠随机分为3组，分别为对照组、对甲酚组和黄葵四物方组，每组5只。对照组大鼠每日上午ig生理盐水1次，对甲酚组及黄葵四物方组大鼠每日上午ig对甲酚水溶液（40 mg/kg）1次，此外，黄葵四物方组大鼠每日下午ig黄葵四物方水溶液（1.25 g/kg[10]）1次，连续ig 10 d。第11天，ig对甲酚5 min后，黄葵四物方组ig黄葵四物方，1 h后眼眶取血，采集的血液置于含有15 g/L EDTA水溶液的EP管中。取血后，ip 2.0%苯巴比妥钠溶液（30 mg/kg）麻醉大鼠。用4 ℃的PBS作为灌流液灌注。实验结束后，大鼠已经死亡。采集大鼠结肠、肝脏和肾脏。血液和脏器样品处理同“2.3.1”项，按照“2.2”项的方法测定PCS含量。

表3 大鼠和小鼠的靶基因引物

2.4 黄葵四物方对宿主体内PCS转运的影响

2.4.1 黄葵四物方对小鼠体内PCS转运进入肾脏的影响 取C57BL/6雄性小鼠9只，随机分为2组，对照组为4只，黄葵四物方组为5只。对照组每日ig生理盐水1次；黄葵四物方组ig黄葵四物方水溶液（2.5 g/kg），连续ig 28 d。第28天，对照组和黄葵四物方组小鼠ip PCS（20 mg/kg），0.5 h后眼眶取血。实验结束后，用2.0%苯巴比妥钠（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，采集小鼠肾脏，脱颈椎处死小鼠。血液和脏器样品处理同“2.3.1”项，按照“2.2”项的方法测定PCS含量。

2.4.2 黄葵四物方对小鼠肾脏中机阴离子转运体OAT1/3 mRNA和蛋白表达的影响 实验分组和给药同“2.4.1”项。取小鼠肾脏组织加入2颗钢珠并用Trizol试剂进行研磨裂解，12 000×离心10 min，取上清，加入氯仿萃取静置分层，12 000×离心15 min，取最上层溶液，加入异丙醇充分混匀，静置，12 000×离心10 min，弃上层液体，加入75%乙醇涡旋，7500×离心5 min，取上清，3次，弃去液体，倒扣晾干，加入DEPC水复溶RNA，仪器检测。并按照逆转录试剂盒说明书转录得到互补的cDNA，最终使用PCR基因扩增仪进行扩增。PCR反应每个样品进行3次重复实验，PCR扩增反应条件为94 ℃预变性30 s，然后进入循环阶段，每个循环包括94 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，共45 个循环。最后以目的基因与GAPDH的含量比值表示目基因的表达水平。使用的引物序列见表3。扩增数据按照2−ΔΔCt的方法进行数据处理。

将小鼠的肾脏组织用RIPA裂解液以及蛋白酶抑制剂Cocktail进行裂解，蛋白浓度用BCA试剂盒进行检测。配制浓缩胶和10%的分离胶，并加入相同蛋白含量的样品进行样品分离，用PVDF膜转膜。5%的牛奶室温封闭PVDF膜1 h，封闭后用OAT1、OAT3抗体（1︰1000）稀释，4 ℃过夜孵育，然后用相应的二抗进行孵育，曝光，获得目的蛋白及内参蛋白GAPDH的灰度值。

2.4.3 黄葵四物方对大鼠体内PCS转运进入肾脏的影响 取SD雄性大鼠16只，随机分为2组，分别为正常组和黄葵四物方组，每组8只。对照组ig生理盐水，黄葵四物方组ig黄葵四物方（1.25 g/kg），连续ig 28 d。第28天，对照组和黄葵四物方组大鼠ip PCS（10 mg/kg），0.5 h后眼眶取血；取血后，ip 2.0%苯巴比妥钠溶液（30 mg/kg）麻醉大鼠，在ip PCS 1 h后，对大鼠进行腹主动脉取血，后用4 ℃的PBS作为灌流液灌注。实验结束后，大鼠已经死亡，采集大鼠肾脏。血液和脏器样品处理同“2.3.1”，按照“2.2”项的方法测定PCS含量。对大鼠肾脏中机阴离子转运体OAT1/3 mRNA和蛋白表达量的测定同“2.4.2”项方法。

2.4.4 黄葵四物方对CKD模型大鼠肾脏中和mRNA表达的影响 将18只SD雄性大鼠随机分为2组，模型组和黄葵四物方组各9只。制备CKD模型：两组大鼠每日ig腺嘌呤溶液（200 mg/kg），连续ig 2周。造模结束后，各组大鼠静养1周。1周后开始给药，模型组每日ig超纯水，黄葵四物方组每日ig黄葵四物方（1.25 g/kg），连续ig 56 d。实验结束后，用2.0%苯巴比妥钠溶液（30 mg/kg）麻醉大鼠，用4 ℃的PBS作为灌流液灌注。实验结束后，大鼠已经死亡。采集大鼠肾脏。大鼠肾脏中机阴离子转运体和mRNA表达量的测定同“2.4.2”项方法。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 黄葵四物方对宿主细胞内PCS合成的影响

本课题组前期研究发现黄葵四物方可降低慢性肾病模型大鼠血浆、肝脏及肾脏中PCS的含量，但尚不明确黄葵四物方是干预了PCS的合成环节和/或抑制PCS向肾脏内的转运环节，从而抑制宿主体内PCS蓄积。因此，本研究首先针对结肠和肝脏内PCS的合成环节，探讨黄葵四物方对宿主细胞内PCS合成的影响。

对甲酚ig给予小鼠后可被肠黏膜和肝脏中SULT1A1代谢生成PCS，小鼠血浆及肾脏内PCS水平也相应增加[4]，可进一步观察黄葵四物方对PCS合成环节的影响。黄葵四物方预给药28 d后，各组小鼠ig对甲酚2 h后，利用UPLC-TQ/MS检测小鼠血浆、结肠及肝脏内PCS含量（图1-A）。结果发现，与对照组相比，黄葵四物方可显著降低小鼠血浆中PCS的含量（图1-B），表明黄葵四物方可干预对甲酚向PCS转化的过程。结肠和肝脏是对甲酚向PCS转化的关键部位，检测结肠和肝脏中PCS含量，结果发现，黄葵四物方对肝脏中PCS的蓄积具有一定的抑制趋势（图1-C），不影响肠道中PCS蓄积（图1-D），以上结果提示黄葵四物方可能通过干预小鼠肝脏中PCS的合成，从而减少宿主体内PCS蓄积。

文献报道PCS主要由肠黏膜和肝脏内SULT1A1代谢对甲酚生成[4]。因此，本研究进一步分析黄葵四物方对肠道和肝脏中SULT1A1的影响（图2-A）。利用Westen blotting和PCR方法检测结肠和肝脏中SULT1A1基因和蛋白的表达水平，结果发现，与对照组相比，黄葵四物方对结肠内基因的表达水平存在抑制趋势（图2-B），但不影响其蛋白水平的表达（图2-C），提示黄葵四物方可能不影响肠道内对甲酚向PCS转化过程。黄葵四物方可显著抑制肝脏内SULT1A1基因和蛋白的表达水平（图2-E、F）；此外，酶活力检测结果发现，黄葵四物方不影响肝脏内SULT1A1的酶活力（图2-D）。以上结果表明，黄葵四物方抑制小鼠体内PCS蓄积可能与调控肝脏内SULT1A1水平有关。

A-C57BL/6小鼠实验设计方案 B～D-黄葵四物方ig 28 d后小鼠血浆、肝脏和结肠内PCS含量变化 与对照组较：*P＜0.05

A-宿主体内对甲酚转化为PCS的示意图 B、C-黄葵四物方对小鼠结肠中SULT1A mRNA/蛋白质表达水平的影响 D-黄葵四物方对小鼠肝脏中SULT1A活性的影响 E、F-黄葵四物方对小鼠肝脏中SULT1A mRNA/蛋白质表达水平的影响 与对照组比较：*P＜0.05

为了对以上结果进行验证，进一步观察了黄葵四物方对大鼠体内PCS合成环节的影响。大鼠ig对甲酚及黄葵四物方后，利用UPLC-TQ/MS检测血浆、结肠、肝脏和肾脏内PCS含量（图3-A）。结果发现，与对照组（未给予对甲酚）相比，对甲酚ig可显著升高PCS在血浆和肾脏内的含量，给予黄葵四物方后，大鼠血浆和肾脏内PCS含量存在降低趋势（图3-B、C）。在结肠和肝脏的检测结果中发现，与对照组相比，对甲酚ig后可显著增加大鼠结肠和肝脏内PCS浓度，黄葵四物方可显著降低肝脏内PCS含量（＜0.05，图3-D），但对结肠内PCS含量无显著影响（图3-E）。以上结果表明，黄葵四物方不影响大鼠肠道中PCS的合成环节，但可抑制大鼠肝脏PCS的合成环节。黄葵四物方可干预对甲酚向PCS转化的过程，减少体内PCS蓄积。

A-SD大鼠实验设计方案 B～E-黄葵四物方和对甲酚ig 11 d后大鼠血浆、肾脏、肝脏和结肠内PCS含量变化 与对甲酚组比较：*P＜0.05

3.2 黄葵四物方对宿主细胞内PCS转运的影响

为了观察黄葵四物方对宿主体内PCS转运环节的影响，检测小鼠ip PCS后，血浆及肾脏中PCS含量，从而直接反映黄葵四物方对PCS由血液向肾脏内转运过程的影响。小鼠ig给予黄葵四物方28 d后，ip PCS 0.5 h后收集血浆及肾脏，利用UPLC-TQ/MS检测其中PCS含量（图4-A）。结果发现，与对照组相比，黄葵四物含量度（图4-B、C），提示黄葵四物方可能不影响PCS转运进入肾脏的环节。

文献研究发现，血浆中的PCS可通过肾脏内有机阴离子转运体OAT1/3转运进入肾脏[4]。因此，进一步观察了黄葵四物方对肾脏OAT1/3转运体的影响。结果发现，与对照组相比，黄葵四物方对OAT3的基因转录存在抑制趋势（图4-E），但不影响其蛋白的表达水平（图4-G）。同时发现，黄葵四物方可显著抑制OAT1基因和蛋白的表达水平（图4-D、F），提示黄葵四物方虽然可以抑制OAT1基因和蛋白的表达水平，但对PCS的肾脏转运环节并无显著影响。为了明确黄葵四物方对PCS转运环节的影响，本研究在正常SD大鼠体内进行了验证实验。

将正常大鼠进行黄葵四物方预给药28 d后，各组大鼠ip PCS，利用UPLC-TQ/MS检测血浆及肾脏内PCS含量（图5-A）。结果发现，与对照组相比，黄葵四物方不影响血浆及肾脏内PCS的含量（图5-B～D）。大鼠肾脏转运体OAT1/3的检测结果同样发现，黄葵四物方不影响大鼠肾脏OAT1/3的基因转录及蛋白表达水平（图5-E～G），提示黄葵四物方不影响正常大鼠体内PCS转运进入肾脏。此外，本实验进一步观察了黄葵四物方对CKD模型大鼠体内PCS转运进入肾脏的影响（图5-H）。结果同样发现，黄葵四物方不影响CKD模型大鼠肾脏中OAT1/3的基因转录水平（图5-I、J）。以上结果提示，黄葵四物方不影响大鼠体内PCS转运进入肾脏。

A-C57BL/6小鼠实验设计方案 B、C-血浆和肾脏中PCS的含量 D、E-黄葵四物方对小鼠肾脏中OAT1和OAT3 mRNA表达水平的影响 F、G-黄葵四物方对小鼠肾脏中OAT1和OAT3蛋白表达水平的影响 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

A-正常SD大鼠实验设计方案 B～D-血浆和肾脏中的PCS含量 E、F-黄葵四物方对大鼠肾脏中OAT1蛋白和mRNA表达水平的影响 G-黄葵四物方对大鼠肾脏OAT3 mRNA表达水平的影响 H-CKD模型大鼠实验设计方案 I、J-黄葵四物方对大鼠肾脏中OAT1和OAT3 mRNA表达水平的影响 与对照组比较：*P＜0.05

4 讨论

CKD是由各种原因引起肾脏结构和功能障碍的慢性疾病。根据肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）的水平将CKD分为了5个阶段。随着CKD进程发展，患者肾功能下降，尿毒素不能及时排出体外，体内大量蓄积的尿毒素会损伤患者肾功能，诱发心血管并发症，进一步加快CKD的进展[15]。其中，PCS是当前研究最多的尿毒素[4]。实验研究证实，在人肾小管上皮细胞HK-2中，PCS可激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，降低细胞生存力，诱导炎性细胞因子mRNA水平升高和转化生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）蛋白分泌增加，最终导致肾脏损伤[16]。在心血管系统，PCS蓄积可增加尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶1nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，）、的基因表达，促进ROS的生成，刺激氧化应激反应，最终导致动脉粥样硬化[17]；PCS还可直接激活胞外调解蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2），破坏胰岛素通路，诱发胰岛素抵抗[18]。因此，探索有效抑制体内PCS生成和堆积的治疗策略，对于延缓CKD进展，降低CKD并发心血管事件具有重要意义。

黄葵四物方由黄葵、黄芪、虎杖和姜黄组成。方中黄葵清热解毒，黄芪益气消肿，虎杖利湿退黄，姜黄破瘀止痛。前期研究发现黄葵四物方能够有效抑制CKD大鼠体内尿毒素PCS蓄积，降低其血浆、肝脏及肾脏内的PCS浓度。针对宿主细胞内PCS代谢通路的各个环节，本研究设计了不同动物实验相互验证，分析黄葵四物方对宿主细胞合成及转运PCS的影响。将对甲酚ig给予小鼠，观察黄葵四物方对小鼠体内对甲酚向PCS合成转化环节的影响。结果发现黄葵四物方可干预小鼠血浆及肝脏内PCS的蓄积，但不影响结肠内PCS含量。在肝脏特异性代谢酶的检测中发现，黄葵四物方可显著抑制肝脏内SULT1A1基因和蛋白水平的表达，从而抑制SULT1A1催化对甲酚生成PCS。在大鼠体内进行验证，结果发现黄葵四物方可降低血浆、肝脏和肾脏内PCS含量，其中对肝脏的抑制作用尤为显著。以上结果说明，黄葵四物方抑制体内PCS蓄积可能与调控肝脏内SULT1A1有关。

在PCS转运环节中，将PCS ip给予小鼠，研究黄葵四物方对PCS转运进入肾脏的影响。结果显示，黄葵四物方不影响小鼠血浆和肾脏内PCS的含量。在大鼠体内进行验证，同样发现黄葵四物方不影响其血浆和肾脏内PCS含量，且不影响肾脏内OAT1/3 mRNA和蛋白的表达，即黄葵四物方不影响PCS通过OAT1/3转运进入肾脏。

综上所述，黄葵四物方抑制对甲酚向PCS转化，并最终减少体内PCS蓄积这一作用可能与调控肝脏内SULT1A1有关，但不影响结肠内PCS的合成以及PCS向肾脏的转运（图6）。

图6 黄葵四物方对尿毒素分子硫酸对甲酚在宿主细胞内代谢通路及转运环节的影响

近年来，通过抑制尿毒素生成和/或调控其转运环节减轻CKD肾脏损伤的治疗策略具有广阔发展前景，本研究以蛋白结合型尿毒素PCS的合成及转运为切入点，探讨黄葵四物方延CKD进展的作用机制，为寻找治疗CKD的新靶点，拓展治疗CKD的新思路提供研究基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effect of Huangkui Siwu Formula on metabolism and transportation pathway of urotoxin-cresyl sulfate

LU Jing-bo1, 2, WANG Ying-yi1, 2, PENG Yin1, 2, XU Xue-jun1, 2, CHEN Chen-kai1, 2, DUAN Jin-ao1, 2, GUO Jian-ming1, 2

1. Jiangsu Key Laboratory of High Technology Research of TCM Formulae, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To investigate the effect and mechanism of action of Huangkui Siwu Formula (HKSWF, 黄葵四物方) on synthesis and transport pathways of urotoxin-cresyl sulfate (PCS).The concentration of PCS in plasma and organs interfered by HKSWF were determined by ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/mass spectrometry (UPLC-TQ/MS). Enzyme activity method was used to detect the activity of sulfotransferase1a1 (SULT1A1). The gene transcription and protein expression of SULT1A1, organic anion transporter 1 (OAT1), and organic anion transporter 3 (OAT3) were tested by qRT-PCR and Western blotting.HKSWF could inhibit the conversion of-cresol to PCS in the liver by significantly down-regulating SULT1A1 gene transcription and protein expression levels (< 0.05), thereby interfering the synthesis of PCS in the host cell. The gene transcription and protein expression levels of organic anion transporters in the kidney were not affected by HKSWF, and HKSWF did not affect the transportation of PCS into the kidney.HKSWF can inhibit the formation of harmful urotoxin PCS by modulating the synthesis pathway of PCSand thereby delaying chronic kidney disease (CKD) progression.

chronic kidney disease; uremic toxins;-cresyl sulfate; Huangkui Siwu Formula; sulfotransferase; organic anion transporter

R285

A

0253 - 2670(2021)01 - 0176 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.021

2020-05-11

国家自然科学基金资助项目（81773983）；江苏省研究生科研与实践创新计划项目（KYCX19_1315）

陆静波（1995—），女，硕士生，研究方向为中药药理学。E-mail: 15951878507@163.com

郭建明（1979—），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向为药理学。E-mail: njuguo@njucm.edu.cn

[责任编辑 潘明佳]