健脾止动汤对多发性抽动症模型大鼠细胞因子表达变化的干预研究

王道涵 王素梅 赵荣华 付宗燕 卫利 丁杰

摘要 目的：研究健脾止動汤对多发性抽动症（TS）模型大鼠外周血、结肠、皮质、纹状体细胞因子表达的影响。方法：采用亚氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射法建立TS动物模型，将模型大鼠随机分为空白对照组、模型组、泰必利组、健脾止动汤组。模型组和空白对照组给予0.9%生理盐水灌胃，其余2组分别给予等体积的泰必利混悬液和健脾止动汤颗粒溶液，连续给药6周。给药结束后，采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）分别检测大鼠外周血白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及结肠、皮质、纹状体IFN-γ与TNF-α表达水平。结果：1）健脾止动汤组IL-1、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α表达显著低于模型组（P<0.05）和泰必利组（P<0.05）;2）健脾止动汤组IFN-γ、TNF-α表达较模型组（P<0.05）和泰必利组（P<0.05）显著下降;3）健脾止动汤组IFN-γ、TNF-α表达较模型组（P<0.05）和泰必利组（P<0.05）显著下降，泰必利组IFN-γ、TNF-α表达较模型组无显著变化（P>0.05）。结论：IDPN诱导TS模型存在免疫功能紊乱，健脾止动汤可抑制外周和中枢组织多种炎症介质释放，其抑炎作用可能对控制TS发作具有一定辅助调节作用。

关键词 健脾止动汤;多发性抽动症;亚氨基二丙腈;外周血;结肠;纹状体;皮质;白细胞介素

Abstract Objective：To study the effect of Jianpi Zhidong Decoction on the expression of cytokines in peripheral blood，colon，cortex and striatum of Tourette Syndrome （TS） model rats.Methods：The TS animal model was established by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile （IDPN） and the rates was randomly divided into a blank control group，a model group，a Tiapride group，and a Jianpi Zhidong Decoction group.The model group and the blank control group were given 0.9% normal saline by gavage.The other 2 groups were given equal volumes of Tiapride suspension and Jianpi Zhidongtang Granule solution for 6 weeks.After the administration，enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α and colon，The expression levels of INF-γ and TNF-α in the cortex and striatum.Results：1） The expressions of IL-1，IL-2，IL-6，IFN-γ，and TNF-α in the Jianpi Zhidong Decoction group were significantly lower than those in the model group （P<0.05） and Tiapride group （P<0.05）; 2 ） The expression of INF-γ and TNF-α in Jianpi Zhidong Decoction group was significantly lower than that of model group （P<0.05） and Tiapride group （P<0.05）; 3） INF-γ and TNF-The expression of α was significantly lower than that of the model group （P<0.05） and the Tiapride group （P<0.05）.The INF-γ and TNF-α expressions of the Tiapride group had no significant changes compared with the model group （P>0.05）.Conclusion：IDPN-induced TS model has immune dysfunction.Jianpi Zhidong Decoction can inhibit the release of various pro-inflammatory factors in peripheral and central tissues，and its anti-inflammatory effect may have a certain auxiliary regulatory effect in controlling the onset of TS.

Keywords Jianpizhidong Decoction; Tourette syndrome; 3，3′-iminodipropionitrile; Peripheral blood; Colon; Striatum; Cortex; Interleukins

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.009

多发性抽动症（Tourette Syndrome，TS）是临床上较为常见的儿童神经精神类疾病之一，近年来发病率呈逐年上升趋势。传统认识上倾向于遗传、神经解剖及生化因素占主导地位。但就临床实际来看，感染和免疫因素在TS发生中也占据了相当大比例。国内有研究显示TS患儿细胞免疫存在异常表达，并与患儿抑郁情绪、社交恐惧、紧张焦虑等TS常见共患病密切相关[1]，由此表明免疫系统在某些神经精神类疾病的發生发展中扮演重要角色，或与中枢神经系统相互作用共同致病。

中医认为，人体精神情志调节，血液生成、运输以及免疫系统的有效运行有赖于肝主疏泄、脾主统血功能的正常发挥。课题组认为TS发病的中医病机与脾虚肝亢密切相关，在此基础上设立“扶土抑木”治法并创制健脾止动汤，前期研究显示该方能不同程度纠正脑组织单胺类及氨基酸类递质的异常表达，恢复TS鼠刻板运动行为以及运动兴奋性，达到了中医“平肝抑木”的治疗理念。本研究拟从中医“健脾扶土”为切入点，进一步观察该方对TS鼠免疫系统及不同组织内细胞因子表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠32只，体质量（200±10）g（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001），分笼喂养，自由饮食，温度（24±3）℃，湿度：40%～60%。本实验经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会批准，伦理审查编号：202022。

1.1.2 药物及试剂 泰必利片（江苏恩华药业股份有限公司，生产批号：H32025477）;健脾止动汤配方颗粒（太子参10 g、炒白术10 g、茯苓10 g、陈皮6 g、龙胆草3 g、当归10 g、川芎6 g、钩藤10 g、法半夏6 g，购自北京康仁堂药业有限公司，由北京中医药大学东方医院药剂科负责制成免煎颗粒剂型）。96孔ELISA Kit，IL-1（批号：M170523），IL-2（批号：M170610），IL-4（批号：M170610），IL-6（批号：M170610），IL-10（批号：M170523），TNF-α（批号：M170523），IFN-γ（批号：M170523），上述试剂均购自北京百奥思科生物医学技术有限公司。亚氨基二丙腈（IDPN，美国Sigma，批号：317306）。

1.1.3 仪器 酶标仪（Bio-Rad公司，美国，型号：680）;自动洗板机（北京拓普分析仪器公司，型号：DEM-3）;涡旋振荡仪（海门其林贝尔仪器制造公司，型号：QL-902）;离心机（Eppendorf公司，德国，型号：Centrifuge 5415D）;分光光度计（Therno scientific科技公司，美国，型号：NANODROP 2000）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 SD大鼠分笼适应性喂养7 d，随机分为模型组和空白对照组，前者予以腹腔注射IDPN[250 mg/kg，1 mL/（kg·d）]建立TS动物模型，空白对照组腹腔注射等体积生理盐水，1次/d，连续7 d。大鼠全部表现出不同程度的刻板行为（头部垂直或水平方向抽动，旋转运动）增加，标志模型诱导成功[2]。成功后将模型组动物随机分成模型组、泰必利组和健脾止动汤组，每组8只。

1.2.2 给药方法 空白对照组、模型组给予等量0.9%生理盐水;西药组给予泰必利混悬液（10 mL生理盐水约含21 mg原药，相当于儿童临床剂量的4.2倍）;中药组给予健脾止动汤溶液（10 mL生理盐水约含16 g生药，相当于儿童临床剂量4.2倍），4组均按照10 mL/kg灌胃给药，1次/d，连续6周。

1.2.3 标本采集 末次给药24 h后，断头取脑，低温条件下快速剥离大鼠皮质及纹状体，称重后液氮快速冷冻，转至-80 ℃冰箱保存待测。将收集于血清分离管中的全血标本在室温放置2 h，然后1 000×g离心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 ELISA检测 分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。依次加入100 μL不同浓度的标准品及稀释液，余孔加待测样品100 μL，37 ℃温育1 h。每孔加检测溶液A工作液100 μL，37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，每孔用350 μL的洗涤液洗涤，浸泡1～2 min，重复洗板3次。每孔加检测溶液B工作液100 μL，37 ℃温育30 min。每孔加3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液90 μL，37 ℃避光显色。加终止溶液终止反应。450 nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。依据公式：组织样品含量=测定浓度/样品浓度×样品稀释度进行计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件对数据进行处理，定量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane′s检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10含量比较 模型组外周血IL-1、IL-2、IL-6表达显著高于空白对照组（P<0.05）、IL-10表达显著低于空白对照组（P<0.05），健脾止动汤组IL-1、IL-2、IL-6表达显著低于模型组（P<0.05）和泰必利组（P<0.05），IL-10表达显著高于模型组（P<0.05），IL-4表达各组差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 外周血和结肠IFN-γ与TNF-α含量比较 模型组外周血及结肠IFN-γ、TNF-α表达显著高于空白对照组（P<0.05），健脾止动汤组IFN-γ、TNF-α表达显著低于模型组（P<0.05）和泰必利组（P<0.05）。见表2。

2.3 皮质和纹状体IFN-γ与TNF-α含量比较 模型组皮质、纹状体IFN-γ、TNF-α表达显著高于空白对照组（P<0.05），健脾止动汤组IFN-γ、TNF-α表达显著低于模型组（P<0.05）和泰必利组（P<0.05），泰必利组IFN-γ、TNF-α表達较模型组无显著变化（P>0.05）。见表3。

3 讨论

20世纪70年代后期有学者提出“心理神经免疫学”概念，它将人体行为、心理情绪、大脑神经活动、内分泌和免疫系统等学科相结合，形成了一门全新的综合学科。此后，越来越多的学者开始关注免疫系统异常与某些神经精神疾病的相关性。链球菌感染后可出现TS症状。1998年Sweto等[3]首次定义了“与链球菌感染有关的小儿自身免疫性神经精神障碍（PANDAS）”，并在诊断标准中确立了“短暂的链球菌感染史”“神经精神症状出现或加重与感染相关”，该诊断肯定了感染因素介入以及免疫功能紊乱在TS等神经精神疾病发病中的地位。由此，以免疫系统为切入点的相关实验研究开启了TS病因学探讨的全新视角。例如以自身抗体异常为研究对象发现抗神经元抗体、抗核抗体、抗细胞骨架抗体等在TS患者血清中含量明显升高[4]，以B淋巴细胞为研究对象发现表面D8/17抗原阳性、CD19表面标志物阳性或成为TS和强迫障碍（OCD）易感性标志等[5]。

细胞因子是免疫原或其他刺激剂诱导的由免疫细胞和某些非免疫细胞合成并分泌的可溶性小分子蛋白，在免疫系统、内分泌系统、神经细胞和造血系统等广泛分布[6-9]。作为神经和免疫系统信息传递的重要信使，它与神经递质、内分泌激素等共同组成了机体细胞间的信号分子。根据细胞因子功能不同可分为白细胞介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、趋化因子（chemokin）等。中枢炎症介质对神经系统的影响具有显著差异性，大体表现在影响信号转导和基因调节进而改变兴奋性/抑制性递质的效应强度，通过炎症反应造成脑细胞器质性损伤，以及促进脑细胞及其附属结构的生长发育而改善脑功能等。以TNF-α为例，该物质由活化的Th1细胞产生，具有介导细胞免疫应答，促进细胞毒T细胞分化，激活巨噬细胞杀灭细胞内病原体的作用。有研究显示，链球菌感染诱发的抽动障碍患儿Th1分泌亢进占主导地位，其血清TNF-α水平显著升高;而以甲基苯丙胺诱导的刻板行为大鼠皮质星形胶质细胞内也出现TNF-α过度表达的情况[10-11]。尽管TNF-α本身对神经元无直接毒性作用，但其可通过诱导和刺激炎症介质释放，加剧脑组织损伤。

与中枢细胞因子直接诱发神经细胞损伤不同，外周血中细胞因子的变化往往与机体全身或局部免疫应答及炎症反应有关。其对中枢神经系统的作用相对复杂，主要通过直接穿透血脑屏障作用;或介导血管内皮细胞活化，增加血脑屏障的通透性;或激活外周神经组织上某些因子受体，进而诱发氧化应激反应等。有研究发现，脂多糖暴露下的孕中期大鼠，血清内升高的细胞因子可经脉络丛和脑膜弥散进入仔鼠，并激活海马、皮质和其他脑区星形胶质细胞和小胶质细胞IL-1β受体，使脑组织长期暴露在炎症刺激下，子代可出现包括重复刻板行为在内的孤独症谱系障碍综合征[12]。相较于外周血和脑组织，肠道黏膜血供及淋巴组织丰富，当肠道菌群受感染等因素刺激时释放细胞因子，经肠道黏膜血运系统突破血脑屏障，这些迁移至脑内的细胞因子（如IL-1）通过与脑内巨噬细胞和小血管上皮细胞上特定受体（如IL-1受体）结合，从而干预中枢神经系统的生理活动[13-14]。国外研究表明，较早接受抗生素过度治疗的儿童患自闭症风险提高;自闭症模型小鼠通过脆弱拟杆菌干预可改善肠道黏膜屏障功能及部分行为学症状[15-16]。

中医采用传统辨证思维，认为疾病的发生发展转归过程与邪正消长态势密切相关。《黄帝内经》更是提纲挈领地指出：“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚。”随着脏腑营卫气血学说的建立，正气的功能特点又进一步被延伸和细化，如主机能活动的元气、主抗病能力的卫气、主康复能力的营气。营卫之气运行于人体周身内外，具有防御外邪、营养脏腑、充实经络的作用。二者受水谷精微化生，依赖脾胃之气的强盛。脾气健运，营卫气血充盛，可维持机体正常生命活力和防病抗病能力。五脏学说认为，脾主运化，主统血，它一方面作为后天精微物质的发源地滋养人体，另一方面又作为血液的调节器和过滤器负责其产生、加工和运输。因此，中医脾的涵义既包括现代解剖学中脾脏、胰脏、胃肠道等消化器官概念，同时又是重要的免疫器官，参与细胞免疫和体液免疫[17]。研究表明，脾虚状态下的动物模型，其免疫功能呈现异常变化[18]。以细胞因子表达为例，王洪海和谢鸣[19]发现脾虚证大鼠血清细胞因子水平出现了IL-1β降低、IL-2、IL-6、TNF-α紊乱变化现象。发现脾虚证大鼠小肠组织IL-1β、IL-6水平显著升高，而IL-2、IL-4水平显著降低。钱会南和杨舒[20]发现脾虚证大鼠脑内海马CA1区和下丘脑腹侧核IFN-γ蛋白表达下降，IL-4蛋白表达增加。脾虚证病理模型的细胞免疫的状态在不同组织器官出现了不同程度的应答紊乱和功能低下，这有可能是参与某些疾病发生发展的潜在因素之一。

外周血方面，模型组IL-1、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α表达显著升高，IL-10表达显著下降，IL-4未见改变，表明IDPN诱导TS大鼠出现外周炎症反应，且呈现出促炎功能亢进，抑炎作用相对减弱的特点。结肠和脑组织方面，IFN-γ、TNF-α两指标在模型组均呈现高表达，表明IDPN诱导TS大鼠肠道及脑组织存在炎症反应。实验过程中发现，TS大鼠（包括药物干预组）频繁出现腹泻或湿便，且脑实质呈现不同程度体积减小，上述实验现象也佐证了IDPN诱导的动物模型可造成肠道和脑实质的炎性损伤。从实验结果中可以看出，健脾止动汤组可显著降低外周血IL-1、IL-2、IL-6含量，升高IL-10含量，并显著降低外周血、结肠和脑组织中IFN-γ、TNF-α含量，而泰必利组仅对外周血IL-6，TNF-α以及结肠TNF-α有显著降低作用。表明健脾止动汤能一定程度地抑制炎症介质释放，改善由于炎症反应造成的中枢神经和外周组织损伤，而泰必利在免疫调节方面的作用并不明显。

综上所述，IDPN诱导TS动物模型可造成外周组织和中枢系统免疫功能紊乱。从免疫学角度来推测，大鼠接受腹腔注射IDPN后首先造成局部血液中炎症介质释放，使肠道在应激刺激下，进一步扩大炎症反应并导致菌群功能紊乱。IDPN经血循环到达并破坏血脑屏障，由之前在外周组织形成的炎性因子或免疫复合物直接经受损屏障入脑，或间接刺激脑组织炎症介质释放，引起基底节和皮质区神经细胞炎性损伤。健脾止动汤可抑制上述炎症反应，对外周和脑组织中细胞因子释放具有不同程度地干预作用。从中医角度来讲，健脾止动汤“健脾扶土”抗抽动的治疗理念并非促进“脾生血”以获得更多有效成分，而是通过“脾运化”将血液中产生过多的致病成分逐一清除而实现的。由此可见，抑制促炎反应、恢复细胞因子表达水平有利于改善TS发作及相关肠道并发症。不足的是，本研究未能从病理上给予有力验证，但研究结果为我们从免疫学和微生物学探讨TS发病机制提供了全新思路。

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（2020-10-23收稿 责任编辑：王明）